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目的:观察HBVxsiRNA对HepG2.2.15细胞生长及hTERT与MMP-2基因表达的影响,探讨HBVx基因沉默与肝癌细胞生长与转移的关系。
方法:1.pSIHBV/X质粒的鉴定与扩增。2.HepG2.2.15细胞的培养。3.pSIHBV/X与pEGFP-N1共转染检测转染效率。4.RT-PCR法对沉默效率的评估。5.ELISA法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg的水平。6.MTT法检测细胞的增殖情况。7.AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况。8.Real-timePCR法检测hTERT与MMP-2mRNA表达的变化。9.Westernblot方法检测hTERT与MMP-2蛋白表达的变化。
结果:通过测序验证pSIHBV/X质粒构建正确:经pEGFP-N1评断转染效率为27％;RT-PCR检测HBVx基因的沉默效率为53.6％:pSIHBV/X质粒转染HepG2.2.15细胞后,HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg和HBeAg的水平下降,与对照组比较差异有统计学意义(p＜0.01);转染pSIHBV/X质粒后,MTT法检测结果显示HepG2.2.15细胞的增殖受到抑制,AnnexinV-FITC/PI双染法检测结果显示HBVxsiRNA可促进细胞的凋亡,与对照组比较差异有统计学意义(p＜0.01);Real-timePCR和Westernblot检测结果显示,HepG2.2.15细胞中hTERT与MMP-2基因的mRNA水平和蛋白水平表达分别有不同程度的下调,与对照组比较差异有统计学意义(p＜0.05)。
结论:利用RNA干扰技术抑制HepG2.2.15细胞中HBVx基因的表达,能降低HepG2.2.15细胞中HBsAg和HBeAg的水平、抑制细胞的增殖、促进细胞凋亡;同时对HepG2.2.15细胞中癌症标志基因hTERT与癌症转移标志基因MMP-2在mRNA水平和蛋白水平的表达都有抑制作用。