缺血性脑卒中是一类具有高死亡率和高致残率的脑血管疾病,其主要病理变化是缺血性神经元损伤。许多继发因素在缺血后的脑损伤中发挥重要作用。酸中毒(acidosis)是脑缺血再灌注过程中的常见现象。脑缺血时,由于乳酸堆积和ATP水解产生H+,导致组织酸化,这种情况可以一直延续至再灌注4小时甚至更长时间,高血糖状态下细胞外pH可以降低至6.0。胞外酸化直接激活了酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels, ASICs)。酸敏感离子通道是一类可以被胞外H+激活的阳离子通道,目前为止共发现了6种ASICs蛋白亚型,分别分别由4种基因编码。组织酸化诱发ASICs开放,乳酸堆积以及炎症因子的释放导致ASICs电流增大,大量Na+内流,导致细胞水肿。已有文献报道,同聚体酸敏感离子通道1a亚型(ASICla)通道对Ca2+有较大的通透性,加重胞内Ca2+超载,引起神经元死亡,缺血坏死区增大。尽管已知ASICs,尤其ASICla是脑缺血中非谷氨酸依赖性Ca2+毒性和脑损伤的主要参与者,目前对于ASICs在脑缺血损伤作用机制并不明确,寻找可用于临床的抑制ASICs的有效药物也是难点之一。本论文建立了大鼠海马神经细胞酸中毒模型,在该模型上引入缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation, OGD)和再灌注(reperfusion)的方法,综合应用膜片钳技术、激光共聚焦显微成像技术结合凋亡/坏死特异性检测手段,研究ASICs以及ASICla在酸中毒引起细胞损伤中的作用机制,酸中毒在OGD及再灌注过程中的损伤作用及ASICs在其中的调控机制,为进一步研究酸中毒在脑缺血性中风中的作用奠定基础。同时以常用的中风治疗药物葛根素为对象,研究中药在酸中毒损伤中的保护作用及对ASICs的调控机制。为开发新型的中风治疗药物提供新的思路和靶点。本论文的主要研究结果有：1.建立稳定的酸中毒损伤模型,并判断酸敏感离子通道(ASICs)是否参与酸中毒引起的神经元损伤。实验发现以pH6.0的胞外液造模4小时后,ASICs的阻断剂amiloride以及ASICla的特异性阻断剂PcTxl均能抑制酸中毒引起的神经元损伤,改善神经元活性。2.建立稳定简易的快速给药、灌流系统,结合膜片钳离子通道电流检测技术,检测胞外pH下降对大鼠海马神经元电活动的影响。实验发现胞外pH下降能引起一个幅值较大的慢激活、慢失活的内向电流。ASICs抑制剂amiloride能浓度依赖性地抑制该电流,其最大半数激活电流浓度分别为13.8μM,因此判断胞外pH快速下降激活的通道是ASICs.3.实验发现胞外酸环境能抑制培养了12天以后的神经元产生的自发电流,而这种自发电流是非ASICs依赖性的。4.葛根素对酸中毒损伤中的海马神经元具有保护作用。葛根素与PcTxl联用并不能进一步改善神经元的活性,降低神经元的死亡率。而电生理实验也证明葛根素对ASICs以及ASICla均具有浓度依赖性的抑制作用,由此推测葛根素通过抑制ASICs尤其是ASICla通道的开放保护酸中毒损伤中的神经元。5.实验发现,OGD和再灌注过程中,酸中毒均引起了神经元的损伤,然而与OGD相比,再灌注过程中酸中毒损伤显著加剧。在OGD过程中使用amiloride和PcTxl均没有保护作用,但在再灌注过程中,amiloride和PcTxl均能改善酸中毒引起的细胞损伤,由此推测脑缺血/再灌注中,ASICs,尤其是ASICla的开放对神经元的损伤作用主要发生在再灌注时期,而非缺血时期。此外,电生理实验发现,OGD时,胞外pH快速下降并不改变海马神经元上ASICs通道的幅值、失活时间常数,但是ASICs从脱敏状态恢复至关闭状态的时间大大延长,其恢复时间常数从16.12±2.18s延长至69.54±21.10s,由此引起ASICs开放频率的大大下降,这可能是ASICs在OGD时并不起主要作用的原因。综上所述,本研究的发现是：1)ASICs参与了酸中毒引起的神经元损伤,但是ASICs没有参与酸中毒引起的神经元自发电流的降低；2)葛根素对酸中毒引起的神经元损伤具有保护作用,其作用机制是浓度依赖性的抑制ASICs,尤其是ASICla通道电流；3)缺血再灌注过程中,酸中毒在缺血过程中引起神经元的损伤,再灌注显著加剧了神经元损伤；4)ASICs主要在再灌注时期参与了神经元损伤,导致这一现象的原因是OGD非常显著地延长了ASICs从脱敏状态恢复的时间,由此导致ASICs开放频率的下降。这些结果提示ASICs在脑缺血/再灌注过程中可能起了重要作用,以及葛根素在这一过程中保护神经元的可能机制,具有创新性。