柴胡是我国常用中药材之一,也是多种中成药的重要原料。柴胡含有多种化学成分,其中,合成途径研究较多的成分为柴胡皂苷。在柴胡皂苷的合成途径中,三萜皂苷骨架经细胞色素P450单加氧酶、糖基转移酶及其它后修饰酶催化后形成柴胡皂苷。CRISPR/Cas9基因编辑技术因其具备简单、省时、高效的优势,已广泛应用于玉米、水稻、拟南芥等植物的基因功能研究中。本文开展以下两部分研究:一、构建柴胡糖基转移酶BcUGT3基因的过表达载体,通过发根农杆菌介导的遗传转化获得柴胡转基因毛状根,初步对该基因的功能进行研究,为其它糖基转移酶基因的功能研究奠定基础;二、借助于柴胡毛状根遗传转化体系,尝试CRISPR/Cas9基因编辑技术在柴胡中的应用,为后续将该技术应用于柴胡BcUGT3基因及其它基因的功能研究提供参考。具体研究结果如下:1.以柴胡无菌苗为外植体,通过发根农杆菌SW101介导的遗传转化诱导毛状根,抑菌培养20天左右开始发根,最终获得20个BcUGT3-pK7WG2D转基因毛状根,利用荧光定量PCR对转基因毛状根进行BcUGT3基因和β-AS基因的过表达情况进行分析,初步推测BcUGT3基因可能参与柴胡皂苷的生物合成。2.构建CRISPR/Cas9载体,通过发根农杆菌SW101介导转化柴胡无菌苗,最终得到GFP-1转基因毛状根20个,GFP-2转基因毛状根16个,对这些转基因毛状根进行靶序列扩增,测序,得到3个测序峰图为双峰的株系,说明这3个株系可能编辑成功,通过进一步克隆测序,发现2个转基因毛状根株系被编辑:GFP-1-10中在152 bp发生1个碱基替换,GFP-2-1在327 bp发生1个碱基插入或在220 bp有1个碱基替换。