论文部分内容阅读
随着人类生活水平的提高,对日常饮食的营养化、多样化也有更高的需求。罗非鱼是世界水产业主要的淡水养殖鱼类,被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。新鲜度是影响鱼类品质及消费者选择的关键因素,如何在贮藏、加工及销售过程中快速而准确地评价鱼类的新鲜度是水产品研究中的主要内容,目前常通过感官、物理、化学、微生物4个方面评价鱼类的新鲜度。蛋白质在鱼类中的含量较高,且是引起鱼类腐败变质造成新鲜度下降的主要原因,而现有的关于蛋白质与新鲜度变化间关系的研究较少。蛋白质组学研究方法以双向电泳(two dimensional electrophoresis,2-DE)、质谱(mass spectrometry,MS)、生物信息学(bioinformatics)为主要技术,能够对研究对象的所有蛋白质进行分析,现已逐渐应用于水产品的研究中。已有研究采用蛋白质组学技术筛选水产品贮藏期间的差异蛋白质作为鲜度指示物,为水产品新鲜度评价提供新的研究思路和方法,关于罗非鱼的蛋白质组学研究尚未有报道。鉴于此,本文以罗非鱼(Nile tilapia,Oreochromis niloticus)为研究对象,开展研究如下:(1)采用感官评价、色差、p H值、挥发性盐基氮(TVB-N)、硫代巴比妥酸(TBA)、菌落总数6个指标,从感官、物理、化学、微生物4个方面对冰藏期间的罗非鱼片新鲜度变化规律进行了研究,为后续对罗非鱼肌肉蛋白质的研究提供参考;(2)研究了罗非鱼肌肉蛋白质在冰藏过程中含量及组成成分的变化规律;(3)优化及建立了适用于罗非鱼肌肉蛋白质的双向电泳体系,为罗非鱼肌肉蛋白质组学研究奠定基础;(4)对冰藏罗非鱼片肌肉进行了蛋白质组学研究,用2-DE分离蛋白质,查找不同贮藏阶段肌肉中的差异蛋白质,用MS技术结合数据库检索对差异蛋白质进行了鉴定及功能分析,筛选出能够表征罗非鱼新鲜度变化的指示蛋白。主要研究结果如下:(1)依据感官评分、TVB-N值、菌落总数能够判断罗非鱼片的新鲜度,p H值与TBA值可作为新鲜度评价参考指标,色差不能很好反应贮藏期间罗非鱼片的新鲜度变化。罗非鱼的新鲜度随贮藏时间延长而降低,综合各指标,建议12 d为冰藏罗非鱼片的货架期终点。(2)罗非鱼片肌肉蛋白质在冰藏过程中发生明显变化,其中3种不同溶解性蛋白质含量均呈下降趋势(P<0.05),说明罗非鱼片肌肉蛋白质的溶解性随贮藏时间延长而显著降低。3种不同结构蛋白质中,肌原纤维蛋白及肌浆蛋白含量持续降低(P<0.05),肌基质蛋白含量无明显变化(P>0.05)。罗非鱼片肌肉蛋白质的分子量分布在10~200 KDa之间,在冰温贮藏过程中肌球蛋白重链(200KDa)、肌动蛋白(45 KDa)和原肌球蛋白(35 KDa)及其它一些蛋白质条带逐渐减弱,在贮藏末期还出现了一些新的条带。(3)优化并建立了适用于罗非鱼肌肉组织的双向电泳体系:用液氮研磨-丙酮沉淀法制备样品,采用24 cm p H 4~7的IPG胶条进行等电聚焦电泳,用12.5%的凝胶进行SDS-PAGE电泳,双向电泳后凝胶采用硝酸银染色法能够得到重复率和分辨率高的2-DE图谱,该技术体系适用于罗非鱼肌肉蛋白质的分离,可用于罗非鱼肌肉蛋白质组学研究。(4)采用2-DE和MALDI-TOF-MS技术对冰藏期间的罗非鱼片肌肉进行蛋白质组学分析,从筛选出的10个差异蛋白质点中鉴定出3个有望作为罗非鱼新鲜度指示蛋白的蛋白质点,经数据库检索可知它们是磷酸二酯酶同工酶(PDE4)、肌球蛋白重链(myosin heavy chain)及β肌动蛋白(beta-actin),分别是与能量代谢、维持细胞结构、细胞运动相关的蛋白质。