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露地菊(Chysanthemum morifolium)为菊科菊属多年生草本宿根植物,其株型矮壮,具有抗寒,抗旱,抗瘠薄,抗病虫,开花繁盛和管理粗放等特性,在园林绿化中占有重要地位。露地菊是典型的短日照植物,对光周期具有依赖性,花期大多集中在9月-10月,花期通常40-50天,在高纬度的寒冷的东北地区,露地菊能够正常繁殖生长,但盛花期恰遇霜冻期,植株受冻萎蔫使其观赏性明显下降、观赏期大幅缩短。为了满足观赏性和市场适应性对露地菊提早开花的要求,可以通过基因工程技术导入外源开花途径的相关基因,使其在露地菊中过量表达,从而达到改变花期的目的。因此,快速获得花期提前的转基因露地菊新品种具有重要的经济意义和推广价值。本试验以改良露地菊‘火焰’的花期出发点,借鉴已有报道的LEAFY基因不仅控制着花序分生组织向花分生组织的转变,而且具有调控开花时间的作用,利用分子生物学手段克隆拟南芥LEAFY基因及转基因相关技术操作,通过甘露糖筛选体系获得抗性植物,并进行后期相关分子实验鉴定,旨在获得花期提前的露地菊‘火焰’早花品系,从而可以为进一步研究和探讨露地菊成花诱导的分子机制打下良好的基础。本研究的主要结果如下:1.基因克隆及表达载体构建。从野生型哥伦比亚属拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.))中克隆AtLEAFY基因,克隆得到基因序列全长1275 bp。利用Gateway技术构建过表达载体pCAMBIA 1301-PMI-AtLEAFY,经过PCR、双酶切等试验的验证,成功将AtLEAFY基因转入表达载体中,并且通过反复冻融法将构建好的过表达载体转入农杆菌菌株EHA105中。2.露地菊‘火焰’的遗传转化及抗性植株的获得。通过农杆菌介导的叶盘法共计侵染露地菊‘火焰’叶片5650片,经过预培养、共培养、前期筛选培养、后期筛选培养、生根筛选培养等阶段,利用载体上生物安全标记phosphomannose isomerase(PMI)基因在含有甘露糖的培养基进行选择压力递增的方式进行筛选,最终获得获得抗性植株218株。3.抗性植株的分子生物学鉴定。对经过甘露糖筛选出的218株抗性植株,利用PCR扩增抗性植株总DNA中的PMI基因和AtLEAFY基因、进一步对初步鉴定的阳性植株进行GUS染色、Western Blot检测阳性植株中PMI蛋白等方法进行相关的分子生物学检测。4.转基因植株的后期表型鉴定。将经过分子生物学鉴定的转基因植株和野生型植株进行炼苗移栽,并同时转入田间,观察转基因植株现蕾时间、始花时间、盛花时间并与野生型植株进行比较,转基因植株花期提前6～14天左右,通过表型鉴定获得9个露地菊‘火焰’早花株系以及2个晚花株系。