丹参毛状根培养条件优化及其诱导效应的研究

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丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科多年生草本植物,其根部组织是我国传统常用的活血化瘀药,其主要药用成分为丹参酮,具有祛瘀止痛、活血通经和治疗心血管疾病等疗效。近年来,通过代谢工程策略及组织培养技术等现代生物工程手段提高丹参酮产量的研究正陆续见诸报道,这为丹参酮规模化稳定性生产提供了途径。本研究利用已成功导入丹参酮合成途径中关键酶基因SmGGPPS的丹参毛状根为材料,首先探讨转基因株系因代谢途径的改造对培养基中的营养需求改变,并优化该株系生长的营养组分配比。后又运用植物促生菌的分离成分诱导转基因毛状根对药用成分丹参酮的合成,以期最大化提高丹参酮产量。实验取得的结果概述如下:1、运用Plackett-Burman实验,以生物量为响应值,以1/2MS培养基中的各营养组分为因素,运用主效应分析手段探究影响转基因毛状根生长的显著性因子。结果表明:在1/2MS培养基中,对毛状根生长量的影响显著性排列为大量元素、微量元素、维生素、甘氨酸、铁盐、肌醇。2、对Plackett-Burman实验筛选出的显著因子设置-1,0,1三水平进行Box-Behnken实验,进一步优化因子的最适添加量。结果显示:转基因毛状根对大量元素的需求量为原浓度的1.7311倍,微量元素需求量减少为原浓度的0.5234倍,维生素则为原浓度的2.0215倍。验证实验也证实优化培养使得毛状根生物量提高47.99%,此时组织中的总丹参酮含量增加约45%。3、利用植物促生菌桔黄假单孢菌JD37、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌三种菌诱导子和真菌诱导子酵母提取物诱导转基因丹参毛状根,对比各诱导子的诱导效应,以期寻找一类能促进丹参酮合成的新的有效生物诱导子。结果显示:酵母提取物对总丹参酮含量的诱导效果,最大提高至1.86倍;对于二氢丹参酮,最大提高至3.38倍;对隐丹参酮的诱导效果最大达到3.37倍,而对于丹参酮I和丹参酮ⅡA没有明显诱导效果。桔黄假单胞菌的清液和细胞破碎液具有一定诱导效果,其对于总丹参酮的诱导最佳达到1.49倍;对于二氢丹参酮最佳达到1.37倍;对隐丹参酮最大达到1.65倍,对丹参酮I为1.45倍,丹参酮ⅡA为1.78倍。而枯草和地衣两种芽孢杆菌的诱导,对于四种丹参酮含量的影响均不大。本实验在前人研究的基础上探索了转基因丹参毛状根对营养需求的改变,最大化提高了丹参毛状根的生长量,后又用菌诱导子对毛状根进行诱导,并且首次探索了具有植物促生作用的桔黄假单胞菌对其的诱导作用,弥补了该菌诱导转基因毛状根的空白,为丹参的大规模工业化生产奠定一些基础。
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