论文部分内容阅读
铝毒是酸性土壤上限制植物生长和作物产量的最大因子之一。铝诱导植物根系有机酸的分泌是至今报道的最重要的抗铝机制。近十几年来,研究者已在小麦、拟南芥、水稻等植物中鉴定一系列与有机酸分泌相关的抗铝毒基因,如位于较上游的C2H2型锌指家族转录因子STOP1,以及柠檬酸转运体MATE基因,进一步的阐明铝胁迫下植物根系有机酸的分泌过程。然而关于细胞膜上铝信号的接收,转录因子、转运体蛋白等的磷酸化修饰至今没有报道。已知蛋白激酶在感知信号和内部信号转导中起至关重要的作用,而生理和药理学实验也表明蛋白激酶参与到铝诱导植物根系有机酸的分泌中来。因此通过分子生物学手段来分析蛋白激酶的功能可能进一步揭示铝胁迫下有机酸的分泌过程。铝胁迫下柠檬酸的分泌是大豆重要的抗铝机制。本实验室前期的基因芯片结果表明,铝胁迫下一系列的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因转录丰度上调,因此,本论文选择其中的两个基因Gm FERL和Gm NEK4L,以大豆耐铝和敏感品种吉育70和吉育62作为试验材料,从基因型间、时空、专一性等转录表达模式,亚细胞定位,超表达于大豆发根和拟南芥等方面对Gm FERL和Gm NEK4L基因在大豆耐铝中的功能进行初步的分析,探讨这两个基因在大豆耐铝中的作用。具体的实验结果如下:1、在Time course实验中发现,两基因在大豆根尖均为组成型表达,但30μmol Al Cl3处理2h后,Gm FERL和Gm NEK4L转录均上调,4h达到峰值,但6h后下降至无铝处理的水平。在2h和4h时,两个基因在耐铝品种吉育70中的表达均高于铝敏感品种吉育62。与对照相比,铝处理下,Gm FERL和Gm NEK4L在根尖0-1厘米的转录表达均显著增加,Gm FERL在根尖0-1 cm,和1-2 cm转录表达高于根尖2-3 cm,而Gm NEK4L在根尖0-1 cm的转录表达则低于1-2 cm和2-3 cm。在组织表达分析中发现,Gm FERL和Gm NEK4L在大豆整株中均有表达,Gm FERL在豆荚中转录表达高于根系。Gm NEK4L在花、豆荚中的转录表达与根中相近。在专一性实验分析中发现,除铝外,铜胁迫也能引起Gm FERL和Gm NEK4L在大豆根尖的转录表达,而其他金属如Cd,La和缺铁处理均对两个基因的转录表达无明显影响。Na Cl胁迫下,8h内Gm FERL和Gm NEK4L两个基因转录表达增加,12h下降,之后呈现下降趋势。ABA处理下,Gm NEK4L从0h到24h表达量逐渐升高,但Gm FERL没有明显响应。2.以35S Ca MV为启动子,利用Gateway系统将基因构建到载体p ENSG-N-GFP上,转化野生型拟南芥原生质体中,通过显微镜的观察,确定这两个基因都是定位在细胞核。3.将Gm FERL和Gm NEK4L基因分别构建到带有LUC标签的植物表达载体p EGAD-3XHA-LUC上,利用农杆菌Agl0介导,蘸花侵染拟南芥,通过筛选得到过表达植株T2代,等待后期的进一步表型分析。将Gm FERL和Gm NEK4L基因构建到植物表达载体p EGAD-3XHA-LUC上,利用发根农杆菌K599转大豆发根,但通过LUC标签检验,没有得到超表达的发根。需进一步的条件优化转化。