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研究背景及目的随着人类生存环境的恶化,饮食结构的多样化,生活习惯的差异,癌症的发病率和死亡率呈逐年递增的趋势。传统放化疗和手术治疗存在疗效差,敏感度低,治疗不彻底等缺点。因此,寻找特异性高,副作用小的肿瘤治疗新方法是目前为止国内外学者的重要研究课题之一。光动力疗法(Photodynamic Therapy, PDT)以其安全、有效、副作用小、特异性强、协同性好、重复性高和相对成本低等优点脱颖而出,已成为世界肿瘤防治疗法中最活跃的研究领域之一。相关研究发现,光敏剂是影响PDT抗癌效应的关键因素之一。目前,全球范围内应用PDT进行临床治疗的光敏剂主要是1996年美国FDA批准的Photofrin,数万例皮肤癌、乳腺癌、食管癌、膀胱癌、头颈癌等患者已经接受了Photofrin-PDT治疗。但Photofrin有效成分不明确,皮肤光毒性大、价格昂贵等缺陷阻碍了其在临床治疗中的应用。新型光敏剂华卟啉钠(Sinoporphyrin sodium, DVDMS)是从Photofrin中提取,优化获得的纯度为98.7%的卟啉二聚钠盐,具有水溶性好、成分明确、暗毒性低、单线态氧产率高、移植瘤抑制率高、肿瘤组织选择性好等优点,并且我国拥有自主知识产权、质量可控、能产业化生产。目前,已有研究报道显示,DVDMS-PDT能够引起肿瘤细胞微丝解聚,抑制癌细胞恶性转移,诱导肿瘤细胞凋亡。然而,微丝作为细胞迁移动态过程中的结构基础,其在DVDMS-PDT抑制肿瘤细胞转移过程中的作用仍然不得而知。并且新型光敏剂DVDMS介导的光动力疗法诱导癌细胞发生凋亡和自噬时,胞内MAPK家族以及抗氧化防御酶血红素加氧酶1(HO-1)在氧化应激刺激过程中的表达变化有待进一步探究。本课题在国家自然科学基金“新型光敏剂DVDMS声、光活性分析及抗肿瘤机制研究”的资助下,主要探究DVDMS介导的光动力疗法引起的微丝解聚与细胞迁移抑制之间的关系。并且,进一步研究了细胞凋亡和自噬应答及MAPK磷酸化和HO-1表达上调的相关分子机制,为DVDMS的新药研发以及癌症靶向治疗提供相关理论依据。研究方法及结果第一部分DVDMS-PDT对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖,凋亡,迁移能力的研究实验主要采用MTT法、Viacount、流式细胞仪检测、TUNEL染色以及划痕实验研究了DVDMS-PDT对MDA-MB-231细胞增殖,凋亡和迁移能力的影响。结果显示：① DVDMS-PDT能够显著抑制MDA-MB-231细胞增殖,且具有光照强度和DVDMS浓度依赖性。② DVDMS-PDT可以诱导MDA-MB-231细胞凋亡的发生,呈现出DNA片段化,核物质凝集等细胞凋亡特征。③ DVDMS-PDT能够显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移。第二部分活性氧是DVDMS-PDT引起F-actin微丝解聚的关键因素实验通过流式细胞仪分析,MTG染色以及FITC-phalloidin标记结合荧光显微镜观察研究了DVDMS-PDT处理后活性氧的产生、DVDMS的亚细胞定位、微丝结构的变化以及活性氧对微丝解聚的影响。研究结果显示：④ DVDMS-PDT处理后,流式细胞仪检测到细胞内有大量活性氧的产生,提示活性氧在DVDMS-PDT杀伤MDA-MB-231细胞中发挥重要作用。② DVDMS主要定位在MDA-MB-231细胞的线粒体,提示线粒体可能是DVDMS-PDT损伤细胞的主要靶细胞器之一。③ DVDMS-PDT处理后,胞质中F-actin微丝束解聚,细胞皱缩,且具有显著的时间依赖性。④活性氧抑制剂NAC处理后,荧光显微镜观察发现胞质中丝状微丝束略有重组装的现象,表明活性氧的产生可能是引起F-actin微丝解聚的主要因素。第三部分F-actin微丝结构的改变对细胞凋亡和细胞迁移的影响实验通过使用微丝稳定剂Jasplakinolide,结合流式细胞仪和Transwell小室实验研究细胞凋亡和细胞迁移的变化。结果显示：① Jasplakinolide预处理后,细胞中丝状微丝束略有重现,且对细胞基本没有毒性。② Jasplakinolide预处理后,细胞迁移率显著升高,表明F-actin微丝解聚是DVDMS-PDT抑制细胞迁移的关键因素。③ Jasplakinolide预处理后,细胞凋亡率没有发生明显变化,提示微丝解聚似乎与细胞凋亡没有直接关联。第四部分DVDMS-PDT对人食管癌Eca-109细胞生长抑制及凋亡和自噬的研究实验通过MTT检测研究DVDMS-PDT对Eca-109细胞存活的影响,通过流式细胞仪分析、形态学观察和western blotting检测研究DVDMS-PDT诱导Eca-109细胞凋亡和自噬性死亡。研究结果显示：① DVDMS-PDT能够显著抑制Eca-109细胞增殖,且具有光照强度和DVDMS浓度依赖性。② DVDMS-PDT处理诱导Eca-109细胞凋亡；凋亡相关蛋白Caspase-3活化水平显著升高,随着时间的延长剪切片段逐渐增加且一直持续到处理后12 h。③ MDC示踪自噬泡显示PDT处理后4 h胞内出现大量的绿色荧光斑点；Western blotting检测LC3在PDT处理后3h开始转化,并且一直持续到24 h,表明DVDMS-PDT可诱导Eca-109细胞自噬。④加入自噬抑制剂LY294002后,Caspase-3剪切片段减少,提示自噬抑制剂的加入使DVDMS-PDT诱导的细胞凋亡下降。第五部分活性氧是DVDMS-PDT诱导Eca-109细胞MAPK通路激活,血红素加氧酶(HO-1)表达上调的主要机制实验采用活性氧抑制剂NAC预处理,Western blotting检测探究活性氧对MAPK信号通路激活和HO-1表达上调的影响。研究结果显示：① p38MAPK和JNK的磷酸化水平在DVDMS-PDT处理后3h表达量最高,随后逐渐降低；HO-1在处理后0h表达量最大,提示DVDMS-PDT处理后,迅速激活HO-1的表达上调以抵御细胞内的氧化应激环境,随后p38MAPK和JNK的磷酸化进一步调控下游细胞增殖和细胞凋亡相关的应答元件。②加入活性氧抑制剂NAC后,p38MAPK磷酸化水平以及HO-1的表达均下调,表明活性氧的产生是p38MAPK磷酸化和HO-1表达上调的主要原因。结论DVDMS-PDT通过诱导活性氧的产生引起MDA-MB-231细胞微丝解聚,微丝结构的破坏是细胞迁移能力下降的关键因素,但其与细胞凋亡似乎没有直接关联; DVDMS-PDT能够诱导Eca-109细胞凋亡和自噬的发生,而活性氧是p38MAPK磷酸化和HO-1表达上调的主要机制。