论文部分内容阅读
Pokemon是POK转录因子家族中的一员,具有原癌基因的活性,在多种肿瘤中均高表达,但其在肝癌细胞中的深入研究较少。我们实验室前期研究结果已经证实了Pokemon在肝细胞癌中高表达,并且通过AKT及ERK依赖性信号通路促进肝癌细胞的增殖和迁移。肿瘤的发生不仅与细胞的异常增殖和分化有关,也与细胞凋亡的异常相关。细胞凋亡有两条经典凋亡信号途径：一是死亡受体激活途径,另一条是线粒体-细胞色素C途径。两条通路的活化最终均可导致caspase通路的活化。本课题拟验证在第三代铂类化疗药物奥沙利铂的凋亡诱导下,Pokemon通过介导这两条凋亡信号途径从而参与肝细胞癌的发生发展。本课题研究中,我们首先采用短发夹RNA稳定转染HepG2和SMMC-7721两株肝癌细胞株,并筛选稳定沉默Pokemon表达的肝癌细胞株。通过TUNEL凋亡检测及流式凋亡检测证实在奥沙利铂的凋亡诱导下,沉默Pokemon之后肝癌细胞凋亡率明显增加。其次,我们进一步探讨Pokemon沉默促进细胞调亡相关分子信号通路。 Western blots结果显示沉默Pokemon表达的肝癌细胞中P53及其磷酸化水平明显增加,从而启动线粒体及死亡受体介导的凋亡途径。在HepG2肝癌细胞中,线粒体介导的凋亡途径中,Bcl-2凋亡家族中的成员(包括Bad、 Bid、Bim、Puma)及AIF的表达增加,线粒体膜势能降低促进细胞色素C的释放。另外,在奥沙利铂的凋亡诱导下,沉默Pokemon表达的肝癌细胞中Fas受体、FADD及其下游的靶基因Caspase10及Caspase8被激活。Caspase8活性片段p18、p10的释放并进一步激活下游的的靶基因如Caspase9及Caspase3。再次,我们还探讨了Pokemon沉默对细胞周期的影响。流式细胞周期分析显示Pokemon基因沉默的HepG2在G1期分布增加,S期细胞分布减少；RT-PCR结果显示抑制细胞周期进展的细胞周期检控点基因在Pokemon低表达的细胞株中表达增加。综上,我们得出结论Pokemon通过死亡受体／线粒体介导的caspase依赖性通路抑制肝癌细胞凋亡,从而参与肝癌细胞内源、外源性细胞凋亡途径的调控；此外,Pokemon可能通过调控细胞周期检控点从而调节肝癌细胞周期的进展。因此,我们推测Pokemon可以作为人类癌症治疗中的新型化疗的靶基因。