目的:(1)本研究利用基因芯片及生物信息学技术,筛选出2型糖尿病中差异表达的lncRNAs和mRNAs,初步探索差异表达的lncRNAs在2型糖尿病中的分子机制。(2)筛选出差异倍数FC(abs)在2.0倍以上并且P≤0.01的lncRNAs,最终在查阅文献的基础上选取MEG3、MALAT1和MIAT基因。在2型糖尿病患者及对照组外周血中检测其表达水平,分析其表达水平与2型糖尿病患者相关危险因素的关系,探讨MEG3、MALAT1和MIAT基因在2型糖尿病诊断中潜在的意义。(3)深度了解内皮细胞的lncRNAs,对于糖尿病并发症可能提供了全新的生物标记物和治疗靶点。理解糖尿病诱导的内皮细胞功能障碍和确定全新的治疗靶点对于预防和减少糖尿病并发症非常重要。目前,MEG3在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)功能障碍中发挥作用的潜在分子机制还未见报道。因此,本研究的目的是探讨MEG3是否可以作为高糖诱导内皮细胞功能障碍的潜在调控者和分子生物标记物。方法:(1)选择2型糖尿病患者及非2型糖尿病患者各5例,抽取各自血液样本,分别提取RNA后,利用基因芯片对lncRNAs和mRNAs进行表达分析。应用生物信息学方法,包括Pathway、Disease和基因本体论(gene ontology,GO)分析,分析2型糖尿病外周血中lncRNAs及mRNAs的表达谱。同时,进一步分析差异基因可能调控的相关通路,进而发现与2型糖尿病发生发展过程相关的lncRNAs,构建lncRNAs和mRNAs的共表达网络,预测差异表达的1ncRNAs可能参与的生物功能。(2)选取200例2型糖尿病患者及200例非2型糖尿病患者,采用实时荧光定量PCR方法检测2型糖尿病组和对照组中MEG3、MALAT1和MIAT的表达水平,采用ROC曲线探讨外周血中MEG3、MALAT1和MIAT的表达水平在2型糖尿病中诊断的价值。(3)运用MEG3的特异性小干扰RNA(siRNA)和scrambled siRNA的慢病毒载体感染HUVECs,运用实时荧光定量PCR检测炎症细胞因子、TGFβ信号通路和Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达,应用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用MTT实验检测细胞增殖,应用western blot检测凋亡相关蛋白、TGFβ信号通路和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达。结果:(1)2型糖尿病患者外周血中差异表达的lncRNAs有68条,其中上调的有44条,下调的有24条;差异表达的mRNAs有74条,其中上调的有56条,下调的有18条。(2)表达差异的mRNAs显著富集的信号通路包括突触小泡周期通路、卵巢类固醇生成通路、癌症的micro RNA通路、细胞色素P450介导的异生素代谢通路和化学致癌作用通路等。显著富集的疾病包括Keutel综合征、遗传性混合性息肉病综合征、其他体液免疫缺陷疾病、脑脓肿黄瘤症和色素性视网膜炎(RP)等。(3)在生物过程中,显著富集的Gene Ontology功能包括可见光的检测、检测光的刺激、骨矿化的调节、生物矿物组织发育的调节和解剖结构排列等。在细胞组件中,显著富集的Gene Ontology功能包括内吞囊泡膜、细胞质小泡膜、囊泡膜、神经元投影和神经元的一部分等。在分子功能中,显著富集的Gene Ontology功能包括脂蛋白转运蛋白活性、胆固醇羟化酶活性、胆甾烷三醇单加氧酶活性、微管蛋白-谷氨酸连接酶活性和骨的结构成分等。(4)与对照组MEG3基因的表达量相比,2型糖尿病组MEG3基因的表达量与对照组相比明显降低,差异具有统计学意义(P<0.001)。与对照组MALAT1基因的表达量相比,2型糖尿病组MALAT1基因的表达量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。与对照组MIAT基因的表达量相比,2型糖尿病组MIAT基因的表达量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。(5)在2型糖尿病组全体人群和男性中,MEG3高表达组血糖水平低于MEG3低表达组血糖水平,差异具有统计学意义(P<0.05);在对照组女性中,MEG3高表达组血糖水平低于MEG3低表达组血糖水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。在2型糖尿病组全体人群、男性和女性中,MALAT1高表达组血糖水平高于MALAT1低表达组血糖水平,差异具有统计学意义(P<0.05);在对照组全体人群和女性中,MALAT1高表达组血糖水平高于MALAT1低表达组血糖水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。在2型糖尿病组全体人群、男性和女性中,MIAT高表达组血糖水平高于MIAT低表达组血糖水平,差异具有统计学意义(P<0.05);在2型糖尿病组男性中,MIAT高表达组舒张压水平低于MIAT低表达组舒张压水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。在对照组女性中,MIAT高表达组血糖水平高于MIAT低表达组血糖水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。(6)在2型糖尿病组全体人群和男性中,MEG3基因的表达量与血糖水平呈负相关,差异具有统计学意义(P<0.05);在2型糖尿病组女性中,MEG3基因的表达量与低密度脂蛋白水平呈正相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。在2型糖尿病组全体人群和女性中,MALAT1基因的表达量与血糖、总胆固醇和低密度脂蛋白水平呈正相关,差异均具有统计学意义(P<0.05);在2型糖尿病组男性中,MALAT1基因的表达量与血糖水平呈正相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。在对照组全体人群中,MALAT1基因的表达量与血糖水平呈正相关,差异具有统计学意义(P<0.05);在对照组女性中,MALAT1基因的表达量与血糖和收缩压水平呈正相关,差异均具有统计学意义(P<0.05)。在2型糖尿病组全体人群、男性和女性中,MIAT基因的表达量与血糖水平呈正相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。在对照组全体人群和男性中,MIAT基因的表达量与收缩压水平呈正相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。(7)MEG3表达量的ROC曲线下的面积AUC=0.818(95%CI:0.777-0.859,P<0.001),灵敏度为94.9%,特异度为94.4%;MALAT1表达量的ROC曲线下的面积AUC=0.838(95%CI:0.723-0.954,P<0.001),灵敏度为95.5%,特异度为95.2%;MIAT表达量的ROC曲线下的面积AUC=0.805(95%CI:0.666-0.944,P=0.001),灵敏度为95.0%,特异度为95.0%。(8)分别与48、72、96小时正常糖(Control,5 mM D-glucose)培养的人脐静脉内皮细胞相比,高糖(HG,30 mM D-glucose)刺激48、72、96小时后,MEG3的表达水平以时间依赖方式表达下降。(9)与control组相比,HG组和HG+MEG3siRNA组MEG3基因的表达量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与HG组相比,HG+MEG3siRNA组MEG3基因的表达量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与control组相比,HG组和HG+MEG3siRNA组α-SMA、VEGF、TNF-α和IL-6基因的表达量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与HG组相比,HG+MEG3siRNA组α-SMA、VEGF、TNF-α和IL-6基因的表达量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。(10)与control组相比,HG组和HG+MEG3siRNA组TGFβ1、SMAD2和SMAD7基因的表达量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与HG组相比,HG+MEG3siRNA组TGFβ1、SMAD2和SMAD7基因的表达量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。(11)与control组相比,HG组和HG+MEG3siRNA组β-catenin和Cyclin D1基因的表达量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与HG组相比,HG+MEG3siRNA组β-catenin和Cyclin D1基因的表达量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与control组TCF7L2基因的表达量相比,HG组和HG+MEG3siRNA组TCF7L2基因的表达量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与HG组TCF7L2基因的表达量相比,HG+MEG3siRNA组TCF7L2基因的表达量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。(12)在48、72和96小时,与control组相比,HG组和HG+MEG3siRNA组的细胞OD值明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与HG组相比,HG+MEG3siRNA组的细胞OD值明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。(13)与control组相比,HG组和HG+MEG3siRNA组的细胞凋亡率明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与HG组相比,HG+MEG3siRNA组的细胞凋亡率明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。(14)与control组相比,HG组Bax、Caspase 3和P53蛋白的表达量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与HG组相比,HG+MEG3siRNA组Bax、Caspase 3和P53蛋白的表达量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与control组相比,HG组Bcl-2蛋白的表达量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与HG组Bcl-2蛋白的表达量相比,HG+MEG3siRNA组Bcl-2蛋白的表达量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。(15)与control组相比,HG组和HG+MEG3siRNA组SMAD2和β-catenin蛋白的表达量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与HG组相比,HG+MEG3siRNA组SMAD2和β-catenin蛋白的表达量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)在2型糖尿病中,lnc RNAs和mRNAs有大量的差异表达,提示这些差异表达的lncRNAs参与了2型糖尿病发生发展过程,有可能成为临床诊断与治疗2型糖尿病的新靶点。通过进一步的生物功能信息探索,差异表达的lncRNAs涉及多条信号通路、多种疾病和多项生物功能,为后续2型糖尿病研究提供理论依据。(2)2型糖尿病患者外周血中MEG3表达水平降低、MALAT1和MIAT表达水平增加,ROC曲线分析表明MEG3、MALAT1和MIAT可以作为诊断2型糖尿病的潜在生物标记物。(3)本研究证明了MEG3参与高糖诱导的内皮细胞功能障碍,MEG3在高糖血症的内皮细胞模型中表达下调。此外,MEG3基因敲除能够加剧内皮细胞的炎症损伤。有趣的是,MEG3基因敲除会通过上调Bcl-2蛋白的表达,下调Bax、Caspase-3和P53蛋白的表达诱导细胞的增殖和抑制细胞的凋亡。值得注意的是,MEG3基因敲除通过上调TGFβ1、SMAD2和SMAD7基因和SMAD2蛋白的表达激活TGFβ信号通路,MEG3基因敲除通过上调β-catenin和Cyclin D1基因和β-catenin蛋白的表达以及下调TCF7L2基因的表达激活Wnt/β-catenin信号通路。我们的研究结果表明,对于高糖诱导的内皮细胞功能障碍,MEG3可以作为全新的治疗靶点和分子生物标记物。