卵巢癌是女性生殖器中死亡率最高的恶性肿瘤之一,大多数病人被发现时已广泛扩散,其5年生存率只有25%,盆腔感染或者盆腔炎是卵巢癌的高危因素。近年来,多项流行病学及相关研究结果已证实,许多肿瘤的发生发展与炎症的反复发作使之处于非可控性炎症状态密切相关,靶向抑制炎症介质、炎症相关转录因子或炎性细胞,可以减少肿瘤发生和播散。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs),是炎症进展成癌症的主要桥梁,通过产生诱导型环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)和5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)在肿瘤发生、生长、侵袭和转移中起着重要作用。炎症的病理过程与花生四烯酸(arachidonic acid,AA)代谢、炎性细胞功能和自身免疫过程有关,这些过程相互关联、相互影响。COX-2和5-LOX分别是花生四烯酸转化为前列腺素类(prostaglandins,PGs)、白三烯类(leukotrienes,LTs)代谢产物通路的一种关键酶,代谢产物PGE2和LTB4具有致炎、氧化及对肿瘤的发生、生长有促进作用,通过活化血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)能直接刺激血管生成。VEGF是恶性肿瘤诱导血管生成的重要调控因子,促进血管内皮细胞增殖,并增加其通透性及提高黏附分子在细胞中的表达量,协助肿瘤细胞进入脉管系统而增加肿瘤发生发展的机率。因此减少肿瘤组织中肿瘤相关的巨噬细胞(TAMs)浸润,有效抑制COX-2、5-LOX的生物学效应,阻断花生四烯酸代谢,减少炎性介质PGE2和LTB4的产生,干预非可控性炎症促进恶性转化,可能对肿瘤发生、发展具有重要影响。青蒿鳖甲汤出自清代吴鞠通《温病条辨》。原方组成为青蒿6g,鳖甲15g,地黄12g,知母6g,牡丹皮9g,是治疗热病后期“阴虚内热”的代表方。我国学者在临床用于阴虚内热尤其是“癌热”的治疗效果十分满意,同时还能调节肿瘤患者免疫功能。本课题组前期研究还发现,在合适剂量和合适治疗时间窗,青蒿鳖甲方能有效改善肿瘤组织炎症反应,改善肿瘤低氧微环境,对化疗具有特异性的增敏效应,可以作为肿瘤化疗过程的辅助治疗药物,本项研究已获发明专利授权：青蒿鳖甲组合物在制备抗肿瘤低氧微环境药物中的应用,ZL200910154172.3。基于上述研究背景,本文采用免疫组化技术检测了人卵巢癌组织中花生四烯酸代谢主要关键酶COX-2和5-LOX的表达情况,旨在探讨COX-2、5-LOX在人卵巢癌形成过程中的作用,以及分析COX-2、5-LOX表达强度与卵巢癌临床病理参数间的关系；并以卵巢癌演变中COX-2/5-LOX生物学效应为研究背景,分别以COX-2通路抑制剂美洛昔康和5-LOX通路抑制剂(5-LOX通路下游代谢产物白三烯受体阻断剂)孟鲁司特钠为阳性对照药物,分析比较中药古方青蒿鳖甲汤与该两药对卵巢非可控性炎症恶性转化的干预效应及各自的干预特征。旨在探讨青蒿鳖甲汤对卵巢癌发生的干预作用及其可能机制,为发掘中药名优方剂新的临床价值提供重要的药理学依据。同时还采用了傅里叶变换红外光谱法(FT-IR)分析比较青蒿、青蒿鳖甲组合、青蒿鳖甲全方红外光谱特征吸收峰峰位,为阐明该古方剂对非可控性炎症恶性转化干预作用的物质基础提供初步定性分析资料。实验结果1分析COX-2、5-LOX表达强度与卵巢癌临床病理参数间的关系1.1COX-2和5-LOX在不同卵巢组织中的表达COX-2和5-LOX的免疫组化阳性产物表现为棕黄色颗粒,COX-2主要表达在胞质,5-LOX主要表达在细胞核、核膜、和细胞质中。COX-2、5-LOX在正常卵巢组织中均不表达,在良性卵巢肿瘤中均呈现弱表达,而在交界性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中均为高表达。COX-2在卵巢癌的阳性表达率为77.1%,在交界性肿瘤中的阳性表达率为73.3%,主要为中等或强阳性表达,两者比较差异无显著性。COX-2在正常卵巢和良性卵巢肿瘤中的表达差异无显著性。COX-2在卵巢癌和交界性肿瘤组织中的表达显著高于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织,具有显著性差异(P<0.001)。5-LOX在卵巢癌中的阳性表达率为81.3%,在交界性肿瘤中的阳性表达率为76.7%,两者比较差异无显著性。5-LOX在正常卵巢和良性卵巢肿瘤中的表达差异无显著性。5-LOX在卵巢癌和交界性肿瘤组织中的表达亦显著高于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织,具有显著性差异(P<0.001)1.2COX-2、5-LOX表达与卵巢癌临床病理参数之间的关系COX-2在卵巢上皮性癌不同组织学类型之间表达无差异；病理分级中,G3的表达明显高于G1-G2的表达(P<0.01)；在临床分期中,Ⅲ～Ⅳ期的表达明显高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)。5-LOX在卵巢上皮性癌不同组织学类型之间表达无差异；病理分级中,G3的表达明显高于G1-G2的表达(P<0.001)；在临床分期中,Ⅲ～Ⅳ期的表达也明显高于Ⅰ～Ⅱ期,有显著性差异(P<0.01)。提示COX-2、5-LOX的表达强度与临床分期、病理分级密切相关,而与组织学类型无关。2化学诱导性大鼠卵巢癌COX-2/5-LOX生物学效应的药物干预2.1大鼠一般情况大鼠造模后连续观察36周。给药第9周,美洛昔康组部分大鼠出现肛周溃疡伴有稀便和便血,以后逐渐增多,并延续至给药结束。其它各组没有上述症状。实验第18周(给药第16周),美洛昔康组大鼠平均体重明显低于模型对照组(P<0.01)；肝脏明显肿大,肝脏重量明显高于模型对照组(P<0.05),其余实验组大鼠体重、肝重与模型对照组相比无显著性差异。实验结束时(第36周),模型对照组和青蒿鳖甲汤低剂量组大鼠体重呈明显下降趋势,两组相比无显著性差异；其余实验组大鼠体重都明显高于模型对照组(P<0.05)。青蒿鳖甲汤中、高剂量组大鼠体重与美洛昔康组、孟鲁司特钠组相比均无显著性差异(P>0.05)。实验结束时,各实验组大鼠肝重无显著性差异。2.2降低大鼠卵巢恶性肿瘤诱发率模型组大鼠和孟鲁司特钠组于造模后的第22周起出现卵巢肿瘤,青蒿鳖甲汤低剂量组和美洛昔康组在第26周出现肿瘤,而青蒿鳖甲汤中、高剂量组则在造模后第28周开始出现肿瘤。实验结束(36周)时,模型组大鼠卵巢恶性肿瘤诱发率为84.61%,青蒿鳖甲汤低、中、高剂量组分别为76.92%、46.15%和30.76%,美洛昔康组为53.84%,孟鲁司特钠组为69.23%。青蒿鳖甲汤中、高剂量组和美洛昔康组大鼠卵巢恶性肿瘤诱发率和造模卵巢重量都明显低于模型组(P<0.05)。孟鲁司特钠组大鼠卵巢恶性肿瘤诱发率与模型组相比无显著性差异(P>0.05)。青蒿鳖甲汤高剂量组卵巢恶性肿瘤诱发率与阳性对照药比较显示：与美洛昔康组相比无显著性差异(P>0.05),与孟鲁司特钠组相比有显著性降低(P<0.05)2.3大鼠卵巢肿瘤组织病理学表现大鼠卵巢肿瘤以腺癌为主,肉瘤次之。模型组：诱发腺癌中见肿瘤细胞过度增生,堆积呈条索状,索条弯曲彼此吻合,细胞异型明显,间质受浸润,组织分化程度低。青蒿鳖甲汤低、中、高三个剂量组：诱发腺癌组织分化程度在低、中剂量组多呈低、中度分化,在高剂量组可见异型腺体浸润性生长,多呈中、高度分化。美洛昔康组：诱发腺癌中肿瘤细胞排列呈腺管状,细胞核质比增大,可见核分裂,肿瘤细胞呈中、低分化；孟鲁司特钠组：诱发腺癌中肿瘤细胞过度增生,核异性明显,可见核分裂,伴出血和坏死,肿瘤细胞呈中、低分化。2.4抑制大鼠体内炎性介质PGE2、LTB4产生于实验第18周(给药第16周)结束后采用ELISA法检测各组大鼠血清中PGE2、LTB4浓度。发现青蒿鳖甲汤中、高剂量组对造模大鼠血清中PGE2、LTB4含量有明显降低作用,与模型组相比,有显著性差异(P<0.05)；与美洛昔康组相比,青蒿鳖甲汤中、高剂量组大鼠血清中PGE2含量差异无显著性(P>0.05)；与孟鲁司特钠组相比,青蒿鳖甲汤中、高剂量组大鼠血清中LTB4含量差异无显著性(P>0.05)2.5降低大鼠卵巢肿瘤组织中巨噬细胞浸润用CD68蛋白标记大鼠卵巢肿瘤组织中巨噬细胞。结果显示模型组大鼠卵巢肿瘤组织中可见大量CD68阳性细胞,青蒿鳖甲汤中、高剂量组与模型组相比明显减少(P<0.05,P<0.01)；青蒿鳖甲汤高剂量组与美洛昔康组相比有所降低但无显著性差异,而与孟鲁司特钠组相比具有显著性降低(P<0.05)2.6下调大鼠卵巢肿瘤组织COX-2、5-LOX、VEGF蛋白表达免疫组织化学检测大鼠卵巢肿瘤组织COX-2、5-LOX、VEGF蛋白的表达。结果显示,3种蛋白表达量在模型对照组中均为强阳性表达。与模型对照组相比,青蒿鳖甲汤中、高剂量组及美洛昔康组大鼠卵巢肿瘤组织COX-2、5-LOX、VEGF蛋白阳性表达明显降低,呈弱阳性表达。孟鲁司特钠组的表达量稍弱于模型对照组,呈中等阳性表达。Western-blot定量分析各组大鼠卵巢肿瘤组织COX-2、5-LOX、VEGF蛋白表达情况,结果表明,COX-2、5-LOX、VEGF蛋白在青蒿鳖甲汤中、高剂量组和美洛昔康的表达量较模型对照组显著下降；与美洛昔康、孟鲁司特钠组相比,COX-2、5-LOX、VEGF蛋白在青蒿鳖甲汤高剂量组的表达也明显降低。3.青蒿、青蒿鳖甲组合、青蒿鳖甲全方红外光谱分析红外扫描青蒿、青蒿鳖甲组合、青蒿鳖甲全方三个样品的红外吸收峰峰位,可见青蒿与青蒿鳖甲组合的峰形基本相似,仅在3800,3000cm-1附近增加两个吸收峰。青蒿鳖甲全方除了在3800,3000cm-1附近增加三个吸收峰外,基本集中在1800～1400cm-1区间,及900cm-1以下区间。表明青蒿鳖甲组合、青蒿鳖甲全方的峰形与峰强度系在青蒿峰形基础上在一定区域增加增强。结论1.花生四烯酸代谢关键酶COX-2和5-LOX在人交界性卵巢肿瘤及卵巢癌中观察到都呈高表达,明显高于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织,COX-2与5-LOX的表达与卵巢癌的临床分期、病理分级密切相关。2.青蒿鳖甲汤可降低DMBA诱导大鼠卵巢癌的发生率,减少肿瘤组织中肿瘤相关的巨噬细胞浸润,下调卵巢肿瘤细胞中COX-2、5-LOX、VEGF的表达,并减少炎症介质PGE2、LTB4的产生,与COX-2/5-LOX通路抑制剂相比,青蒿鳖甲汤显示高效低毒的独特优势,推测该古方剂可能具有COX/LOX双重干预作用,通过阻断花生四烯酸的代谢干预非可控性炎症促进恶性转化,对卵巢炎症诱发的恶性肿瘤形成有一定的预防作用。3.经红外光谱分析,青蒿其主要成分大多为极性较小的挥发性成分,青蒿在混入鳖甲胶后,青蒿鳖甲组合物的红外光谱增加芳香胺和脂肪胺的特征峰,青蒿鳖甲全方的红外光谱增加醛、酮、羧基等特征峰。提示青蒿鳖甲配伍地黄、知母、牡丹皮组成方剂可能含有一定抑制肿瘤组织炎症反应的活性成分。