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第一部分骨髓间充质干细胞旁分泌效应对胰腺β细胞系的影响目的:研究胰腺提取物对骨髓间充质干细胞分泌细胞因子的影响,并分析胰腺提取物处理后的骨髓间充质干细胞条件培养液对体外培养的胰腺β细胞增殖、凋亡及胰岛素分泌的影响方法:(1)制备正常大鼠胰腺提取物(normal rat pancreatic extracts,N-RPE),再生性大鼠胰腺提取物(regenerative rat pancreatic extracts,R-RPE),分离培养鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),分别应用N-RPE和R-RPE孵育MSCs获得条件培养液(MSC conditioned media,MSC-CM),分别为N-RPE-CM,R-RPE-CM,并设立无RPE处理的对照组(CTR-CM),ELISA法分析三组CM中IGF-1,HGF,b FGF及VEGF的含量,应用RT-PCR分析RPE对MSCs中细胞因子IGF-1,HGF,b FGF及VEGF mRNA的改变。(2)应用RPE处理后的MSC-CM孵育体外培养的大鼠胰腺β细胞系INS-1细胞,设立单纯RPMI 1640培养基作为对照组(RPMI1640组)。应用MTT分析N-RPE-CM,R-RPE-CM及CTR-CM对INS-1细胞增殖的影响;应用IL-1β,TNF-α和IFN-γ诱导INS-1细胞凋亡,AnnexinⅤ/PI双染分析MSC-CM对INS-1细胞凋亡的影响。应用RIA分析MSC-CM对INS-1细胞分泌胰岛素影响,应用RT-PCR分析对INS-1细胞胰岛素mRNA的影响。结果:(1)骨髓间充质干细胞形态及细胞表型鉴定大鼠骨髓细胞原代培养10～14天细胞可达80%～90%融合,有规律的排列成放射状或旋涡状,经过3代后MSCs基本达到形态均一,流式细胞仪分析第三代MSCs细胞表型,细胞高表达CD44和CD90,而CD34、CD45低表达或表达阴性。(2) MSCs条件培养液IGF-1,HGF,b FGF及VEGF的测定四种细胞因子在三组中均可以检测到,CTR-CM,N-RPE-CM和R-RPE-CM组的IGF-1水平分别为:(123.5±15.3)pg/ml,(356.8±35.6)pg/ml和(852.3±53.9)pg/ml,P＜0.01;三组中HGF的水平分别为:(110.5±11.3)pg/ml,(206.5±23.6)pg/ml和(358.5±42.8)pg/ml,P＜0.01;三组中VEGF的水平分别为(78.6±12.6)pg/ml,(206.8±21.6)pg/ml和(702.3±43.6)pg/ml,P＜0.01;三组中bFGF的水平分别为(89.6±11.6)pg/ml,(285.3±25.6)pg/ml和(683.6±42.6)pg/ml,P＜0.01。N-RPE-CM和CTR-CM相比,三种细胞因子的水平也有显著性差异,P＜0.01。(3)胰腺提取物对MSCs中IGF-1,HGF,VEGF及b FGF mRNA的影响RT-PCR结果显示,与对照组(CTR组)相比,经过N-RPE和R-RPE处理MSCs后,IGF-1,HGF,VEGF和bFGF电泳条带均变深,MSCs的IGF-1,HGF,VEGF及bFGF的mRNA相对表达量均明显升高(P＜0.01)。R-RPE组与N-RPE组比较,IGF-1,HGF,VEGF及bFGF的mRNA相对表达量也均明显升高(P＜0.01)。(4)大鼠MSCs条件培养液对INS-1细胞增殖及凋亡的影响应用MTT检测细胞存活及增殖。RPMI 1640组,CTR-CM组,N-RPE-CM组及R-RPE-CM吸光度值分别为0.382±0.016,0.403±0.028,0.519±0.035及0.626±0.048,有显著性差异(P＜0.01),N-RPE-CM及R-RPE-CM组吸光度值升高更明显。应用AnnexinⅤ/PI双染分析INS-1细胞凋亡,荧光显微镜及流式细胞仪观察:凋亡细胞及坏死细胞数在RPE-CM干预组明显减少,以R-RPE-CM组凋亡细胞及坏死细胞最少。(4)大鼠MSCs条件培养液对INS-1细胞胰岛素分泌及胰岛素mRNA的影响5.6 mmol/L葡萄糖浓度刺激下各组胰岛素分泌分别为(ng/ml):0.225±0.019(RPMI1640组)vs 0.242±0.035(CTR-CM组)vs 0.351±0.052(N-RPE-CM组)vs 0.486±0.063(R-RPE-CM组),P＜0.01;20mmol/L葡萄糖浓度刺激下各组胰岛素分泌分别为(ng/ml):0.318±0.021(RPMI1640组)vs 0.346±0.025(CTR-CM组)vs 0.662±0.052(N-RPE-CM组)vs 0.801±0.077(R-RPE-CM组),P＜0.01。分析MSC-CM在葡萄糖浓度11.1mmol/L下对INS-1细胞胰岛素mRNA的影响。与RPMI 1640组相比,经过N-RPE-CM和R-RPE-CM处理INS-1细胞后,胰岛素电泳条带均变深,INS-1细胞胰岛素的mRNA相对表达量均明显升高(P＜0.01)。结论:(1)胰腺提取物可以促进骨髓间充质干细胞分泌IGF-1,HGF,VEGF及b FGF,mRNA表达增加,再生性胰腺提取物促进作用更强。(2)胰腺提取物处理后的骨髓间充质干细胞条件培养液促进体外培养的INS-1细胞增殖,抑制其凋亡,促进INS-1细胞胰岛素分泌及mRNA表达(3) MSCs条件培养液的胰腺保护作用提示MSCs的旁分泌效应可能在MSCs移植治疗糖尿病中发挥重要的作用。第二部分骨髓间充质干细胞条件培养液对糖尿病大鼠胰岛细胞的作用目的:探讨应用骨髓间充质干细胞条件培养液对糖尿病大鼠模型的血糖控制、胰岛细胞增殖及凋亡的影响。方法:1%STZ 60mg/kg单次腹腔注射制备糖尿病大鼠模型,分为四组:糖尿病对照组(DM-CTR组,腹腔注射生理盐水),n=6;CTR-CM组(腹腔注射CTR-CM),n=8;N-RPE-CM组(腹腔注射N-RPE-CM),n=8;R-RPE-CM组(腹腔注射R-RPE-CM),n=8。分析条件培养液对糖尿病大鼠体重,血糖的影响;胰腺HE染色分析对胰岛形态的改变,应用免疫组织化学胰岛素及Ki67染色,分析对胰岛细胞增殖的影响;应用TUNEL分析条件培养液对胰岛细胞凋亡的影响。结果:(1)各组体重及血糖的变化,R-RPE-CM组腹腔注射糖耐量试验(IPGTT)情况:DM-CTR,CTR-CM组体重降低,到实验结束时分别降至(141.5±10.3)g及(149.2±11.2)g;N-RPE-CM组和R-RPE-CM组体重变化不明显,分别为(223.7±18.6)g和(231.8±16.9)g,N-RPE-CM组,R-RPE-CM组体重与DM-CTR及CTR-CM组之间有显著性差异,P＜0.01。在治疗之前,四组血糖水平没有显著性差异,P＞0.05;治疗一周后,N-RPE-CM组和R-RPE-CM组血糖开始下降,与DM-CTR组及CTR-CM组相比有显著性差异,P＜0.01。在治疗后的第2,3,4周,N-RPE-CM组和R-RPE-CM组血糖继续下降,而DM-CTR及CTR-CM组则有升高趋势,在第四周DM-CTR组,CTR-CM组,N-RPE-CM组和R-RPE-CM组血糖分别为(25.5±2.0)mmol/L,(24.5±2.1)mmol/L,(13.6±1.7)mmol/L,(7.8±1.8)mmol/L,四组有显著性差异,P＜0.01,其中R-RPE-CM组血糖比N-RPE-CM组更低,有显著性差异,P＜0.01。IPGTT显示治疗后2周及4周与治疗前相比,R-RPE-CM组各时点的血糖均有明显降低,均P＜0.01。(2)胰腺组织学检查HE染色结果:DM-CTR组及CTR-CM组动物胰岛数量明显减少,残存胰岛萎缩,变性坏死,细胞核固缩;N-RPE-CM组胰岛数目少、形态欠完整,但与DM-CTR组及CTR-CM组相比,胰岛细胞坏死明显减轻;R-RPE-CM组胰岛数目明显较DM-CTR组及CTR-CM组增多,体积增大,坏死减轻,水样变性较多。胰岛素染色结果:R-RPE-CM组及N-RPE-CM组胰岛素阳性表达面积与视野中总面积的比例,胰岛素阳性表达面积和胰岛素染色的平均光密度与DM-CTR组及CTR-CM组相比均有显著性差异,P＜0.01。胰岛β细胞增殖情况:DM-CTR组及CTR-CM组Ki67阳性细胞非常少见,两组没有显著性差异,P＞0.05,而N-RPE-CM组及R-RPE-CM组胰岛中Ki67阳性细胞较DM-CTR组及CTR-CM组常见,具有显著性差异,P＜0.01;而R-RPE-CM组Ki67阳性细胞比N-RPE-CM组多见,P＜0.01。胰岛β细胞凋亡情况:在DM-CTR组及CTR-CM组凋亡细胞多见,而经过N-RPE-CM治疗后,与DM-CTR组及CTR-CM组相比明显减少,有显著性差异,P＜0.01;而经过R-RPE-CM治疗后凋亡细胞数与N-RPE-CM组相比明显减少,有显著性差异,P＜0.01。结论:骨髓间充质干细胞条件培养液可以降低糖尿病大鼠的血糖,促进大鼠胰岛细胞的增殖,抑制其凋亡。