随着工农业生长的发展和人口的增长，大量的工业废水和生活污水源源不断的排放入水体，使生活饮用水水源不断受到污染。水中氮、磷含量急剧增加，藻类获取了丰富的营养物质而大量增殖，导致水华现象在世界各地频繁爆发。目前，淡水湖泊水华爆发的频率与严重程度都呈现迅猛增长的趋势。美国、日本、印度、加拿大、南非、芬兰等国家都有湖泊、水库水华爆发的报道。我国近20年来水华现象异常严重，滇池、太湖、巢湖等曾多次爆发水华。北方一些淡水湖泊也不同程度的受到了藻毒素的污染。水华不仅影响水体的感观性状，而且对人类健康也产生了很大的威胁，已引起了全世界的关注和重视。水华所产生的主要污染物质是各种藻毒素，由铜绿微囊藻、水华鱼腥藻、颤藻、念珠藻等产生的微囊藻毒素是其中出现频率最高、毒性最强、急性危害最大的一种细胞内毒素。微囊藻毒素不仅能够引起人体各种炎症损伤，如急性皮肤炎、肝炎、肾炎等，而且能够引发肝癌。因此，开发早期藻毒素污染预警系统、监测系统和分析系统在水华研究中具有十分重要的意义，既可以防治水华危害，减少水华爆发造成的经济损失，又能够有效的保护人们的健康。本课题以郑州市生活饮用水源西流湖和黄河花园口段某调蓄池作为研究现场，检测水华理化指标和指示指标，通过分析各理化指标与总藻细胞密度、叶绿素浓度、蓝藻细胞密度等指示指标之间的关系，进而建立藻类污染预测模型；分离培养微囊藻细胞，检测基因序列并对所提取毒素进行检测分析，从而为藻类污染防治提供了科学依据，为进一步开展微囊藻毒素毒效应机制和去除研究奠定了坚实的基础。材料与方法1．现场与采样选择郑州市西流湖和黄河花园口调蓄池为研究现场。在西流湖水体设两处采样点：1号采样点为柿园水厂调蓄池入口处，2号采样点为调蓄池外围1000m处。采样时间为2004年3月～10月；黄河花园口调蓄池水源入口处为1号采样点，水厂采水处为2号采样点，采样时间为2005年3月-2006年1月。采样时避免下雨天气，每次采样均在上午9：00进行，采样时用2500ml采水器于水面下0.5m处共采集水样12000ml，置于经过处理的2500ml聚乙烯瓶和1000ml玻璃瓶中，用于分析水体理化指标、蓝藻细胞密度和总藻细胞密度。采样同时记录水温、气温、光照度、透明度等理化指标。用25号浮游生物网（网孔直径为0.064mm）在水体表面或水面下0.5m深处以每秒20-30cm的速度作倒8字形循回采样，拖网时间根据浮游藻类的密度选择，一般3～5min。将网徐徐提起，待水滤去，浮游藻类聚集在网头，取盛标本的100ml塑料瓶在网头下接好，打开活塞，使浓缩藻类标本流入瓶中。每个采样点收集30～40ml浓缩藻类样品，进行产毒蓝藻的分离培养、微囊藻纯毒素制备及毒素鉴定。2．检测项目及方法应用照度计法测定光照度（Light illuminance．Li）；采用深水温度计法测定水温（water temperature,WT）；采用塞氏盘法测定透明度（secchi-depth，SD）；采用酸性高锰酸钾法测定高锰酸盐指数(chemical oxygen demand,COD_Mn；采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定总氮（total nitrogen,TN）；采用钼酸氨分光光度法测定总磷（total phosphorus.TP）；采用分光光度法测定叶绿素a（chlorophyⅡa,Chla）；采用血细胞计数板法测定各种藻细胞密度（algae cell density,ACD）和蓝藻细胞密度（cyanobacteria cell density,CCD）；采用全细胞PCR方法检测产毒蓝藻（toxigenic cyanobacteria）相关基因藻青蛋白基因中间序列（phycocyanin intergenic spacer region，PC-IGS）和微囊藻毒素多肽合成酶基因B（microcystin synthetase gene B，mcyB）；采用T载体基因克隆和PCR产物直接测序方法检测蓝藻基因序列；采用ELISA方法测定微囊藻毒素（microcystin,MC）总浓度；采用固相萃取（soLid pole of extraction，SPE）方法对提取粗毒素进行分离纯化；采用（high performance Liquid chromatography，HPLC）方法检测各种毒素异构体及其浓度。3．藻细胞的分离培养应用96孔板结合极限稀释法对采集浓缩藻细胞进行分离培养。选择培养基为BG-11培养基，光照2500LX，光暗比12h：10h，温度25±1℃，每天早晚各振摇一次。4．统计学处理4．1统计分析软件应用DNAssist 1.0和DNATools 5.1对基因序列进行序列分析和比对分析；BLAST软件提交基因序列与GenBank；Excell整理和输入数据；SPSS11.0进行多元回归模型建立及浓度计算；Matlab5.3建立人工神经网络模型。4．2统计方法用评分法和综合营养状态指数法评价西流湖和黄河花园口调蓄池水体富营养化现状；用L-M算法改进的的BP人工神经网络技术和多元逐步回归分析分析方法分析总藻细胞密度、蓝藻细胞密度、叶绿素a与理化指标的关系并建立水华藻毒素污染预测模型。结果1．西流湖和花园口调蓄池水体营养状况评价结果评分法评价结果显示：西流湖春季为轻度营养状态，夏、秋季呈富营养状态；花园口调蓄池四季均为富营养状态；全年评分指数变化趋势：西流湖三季依次由富营养的较小临界值、富营养过渡到富营养的较大值；花园口调蓄池全年呈先逐渐升高然后逐渐降低的趋势。综合评价两水体均为富营养型。综合营养状态指数法评价结果显示：西流湖春季处于中度营养状态的较大值；夏季处于轻度营养状态的较大值；秋季处于中度营养状态的较大边界值；花园口调蓄池全年均呈轻度营养状态。全年综合营养状态指数变化趋势：西流湖由中度营养状态的较大值、轻度营养状态的较大值过渡到中度营养状态的临界值；花园口调蓄池呈先下降然后升高再降低的趋势。2．西流湖和花园口调蓄池各门类藻细胞计数结果西流湖和花园口调蓄池污染藻类主要是硅藻、绿藻、蓝藻和裸藻，其他藻类较少。优势藻门和藻细胞密度具有明显的季节变化趋势，春节浮游藻类种类较多，无明显优势藻门，ACD和CCD均较低；夏季和秋季种类较少，以蓝藻为优势藻门，ACD和CCD均较高；冬季浮游藻种类和密度均为全年最低。3．叶绿素a、蓝藻细胞密度、总藻细胞密度与理化指标关系及微囊藻毒素污染预测模型的建立结果3．1运用多元回归分析方法分析及模型建立结果绘制各理化因子与Chla、ACD、CCD之间的散点图,TP、Li与叶绿素a和CCD不成线性关系，因此，不能进入多元线性回归模型进行分析。剔除TP、Li因子，采用多元逐步回归分析方法，建立郑州市生活饮用水源Chla、ACD、CCD的多元回归预测模型，预测方程如下：（1）ln（Chla+1）=0.626-0.717TN+0.644COD（r=0.855，F=96.213，P=0.0）（2）ln（ACD+1）=14.090+0.206WT-2.771SD-0.824Li-0.289TN+4.608TP(r=0.873，F=43.555，P=0.000（3）ln（CCD+1）=6.154-1.712TN+0.881COD（r=0.854，F=95.849,P=0.000）结果显示：CHLa与COD呈正相关，与TN呈负相关；ACD与SD、Li、TN呈负相关，与WT、TP呈正相关；CCD与TN呈负相关，与COD呈正相关。所得回归方程的预测值与实测值拟和相关系数均大于0.70，预测值与实测值基本吻合，可以适用于藻类污染预测研究。3．2采用LM计算方法优化的BP人工神经网络技术建立Chla、ACD、CCD预测模型结果将6个富营养化相关理化因子全部纳入预测模型的建立，Chla、ACD、CCD预测模型训练误差分别为1e-11、1e-3、1e-13，训练集、校验集、检验集训练误差几乎同时达到最低点，预测值与实测值拟和结果如下：（1）A=0.082T+4.48 （r=0.871）（2）A=0.556T+（3.16e+003）（r=0.838）（3）A=0.608T+798（r=0.869）所得三个预测模型拟和度较好，重要理化因素均进入模型进行分析，所得结果更符合实际，是一种很好的藻类毒素污染预测模型建立方法。4．微囊藻细胞分离培养结果用96孔细胞培养板结合极限稀释法自西流湖分得1株微囊藻细胞Microcystis XLH（师兄分离），自黄河花园口调蓄池共分离2株微囊藻细胞Microcystis BM1、BM2和1株颤藻细胞C3。5．PC-IGS基因和mcyB基因检测和序列分析结果自西流湖分离的XLH细胞株和黄河花园口调蓄池分离的2株微囊藻细胞BM1、BM2，PC-IGS、mcyB基因扩增均为阳性；颤藻PC-IGS扩增阳性，mcyB基因扩增结果为阴性。构建T载体克隆水体微囊藻毒素合成酶基因PCR扩增产物，用PCR通用引物鉴定结果，在800bp左右有条带，成功克隆出菌株。取1ml菌液封装，送上海生工进行测序，用BLAST提交测序结果与GenBank序列比对，同源性最高99.15％，克隆测序成功。所分离3株微囊藻细胞mcyB基因序列检测结果与GenBank报道mcyB基因同源性达99.5％；水体微囊藻毒素合成酶基因序列与所分离微囊藻细胞株毒素合成酶基因序列同源性为99％；将3株微囊藻细胞株mcyB基因序列提交美国生物信息中心基因库（GenBank），所得基因序列号分别为：EF216872、EF216873、EF216874。6．毒素提取纯化及检测结果以MC-LR、MC-RR毒素标准品对提取毒素进行HPLC检测，结果显示：XLH、BM1、BM2所含MC-LR、MC-RR两种异构体的比值分别为47.1、130.9、142.8，MC-LR几乎达到MC-RR的150倍，表明该两个生活饮用水源水华产生藻毒主要为MC-LR。运用ELISA试剂盒对毒素总浓度进行检测，结果显示：自西流湖分离的藻细胞株XLH干粉产毒量为471.4μg/g，而黄河花园口段某调蓄池所分离的两株微囊藻细胞干粉产毒量均分别为1068.4μg/g和4697.2μg/g。一般微囊藻干粉产毒量为300μg/g～2000μg/g，BM2远远大于该平均水平。结论1．西流湖和黄河花园口调蓄池呈不同程度富营养化状态，均有微囊藻毒素污染。2．应用96孔板结合极限稀释法对水体藻细胞进行分离可以大大简化分离过程，提高水华藻细胞分离效率。3．全细胞PCR方法可以用来鉴定水样和蓝藻细胞株产毒性。本实验室所分离的三株微囊藻细胞为蓝藻种属，且能够产毒。4．所分离三株微囊藻细胞主要毒素异构体为毒性较大的MC-LR，均为水体微囊藻毒素污染来源。5．能够运用人工神经网络技术和多元回归分析方法建立藻类污染预测模型；改进的人工神经网络技术较多元回归分析方法更为优良和实用。6．为郑州市安全供水及水源卫生防护提供了科学依据，为深入开展微囊藻毒素毒效应机制和去除研究提供了基础数据和方法。