论文部分内容阅读
金属离子对植物的正常发育至关重要,但过量又会使植物中毒影响其生长。植物体有维持其内稳定的自动调节平衡机制,通过对金属离子的吸收和运输进行调节从而控制植物体内金属离子的含量,这个机制主要由植物金属离子转运蛋白完成。NRAMP(Nature Resistance Associated Macrophage protein)家族是金属转运蛋白家族的重要成员之一,被定义为转运二价金属离子相关蛋白的一个新家族,它是进化和同源性上保守性非常高的金属转运家族,广泛存在于原核生物和真核生物当中。本研究主要以模式植物拟南芥为材料,通过查询基因以及引物设计和实验操作等方法获得目的基因AtNRAMP3的序列,其基因大小为1530bp,通过亚细胞定位证明了 AtNRAMP3定位在液泡膜。已知AtNRAMP3主要调节Fe、Mn和Cd的转运,我们利用酵母野生型及其突变株△Ccc1、△Smf1和△Ycf1,通过定点突变和功能互补实验鉴定NRAMP3上的关键氨基酸来研究其分子结构和功能。主要结果如下:通过比对NRAMP转运蛋白家族基因序列,在NRAMP3序列中发现了一些保守性很高的氨基酸残基,将这些位点的氨基酸定点突变为丙氨酸,与PFL61载体连接构建表达载体转化上述酵母突变株,通过观察转化株在条件培养基中的生长情况,分析这些氨基酸残基的作用以及AtNRAMP3转运金属离子的分子机制。我们的分析证明D72,N75,C245以及M248四个组成金属离子结合位点的氨基酸残基对于AtNRAMP3转运Fe有重要的影响,这四个氨基酸的突变改变了金属离子的选择性,使AtNRAMP3不能转运铁离子,其中,D72,N75和M248的突变也使AtNRAMP3丧失了转Mn的功能,推测这三个残基对于识别和结合金属离子有重要的作用。在跨膜螺旋TM1和TM6上的一些氨基酸通过改变AtNRAMP3的构象使其保持在向内或向外的锁定状态而不能结合金属离子。一些保守性较高的保守区氨基酸的突变也使AtNRAMP3丧失了转运Fe、Mn等离子的功能,这些高保守区的氨基酸如何对AtN RAM P 3结构产生作用和怎样影响它的功能需要进一步探究。