随着现代社会的迅速发展,人们生存环境和生活方式发生变化,以及日益增加的精神压力等因素,不孕不育患者呈逐年增长的趋势,已成为影响人类健康与发展的全球性医学及社会学问题,越来越受到世界各国的关注。体外受精-胚胎移植(IVF-ET)是目前治疗不孕症的主要手段之一,给广大不孕不育患者带来了福音。但IVF-ET仍存在低成功率和高流产率的问题,因此如何进一步提高不孕患者临床妊娠率、降低流产率是辅助生殖技术研究的热点课题。据研究报道,导致IVF-ET失败的原因1/3是由于卵子质量及胚胎内在缺陷,而2/3则取决于子宫内膜,子宫内膜容受性在胚胎成功着床中发挥着重要的作用。胚胎着床期间,子宫内膜发生一系列变化为胚胎种植创造适宜的微环境。课题组在前期研究发现,补肾法、疏肝法能够改善控制性超促排卵患者妊娠结局。本课题拟在前期研究的基础上进一步观察补肾法、疏肝法对子宫内膜容受性的影响及其作用机制,以期更深入完善探讨两法改善妊娠结局的作用机理,为中医药在辅助生殖领域中的应用提供实验依据。第一部分Sphk1在正常月经周期子宫内膜中的表达及其与雌孕激素受体和血管内皮生长因子的关系目的:研究Sphk1在正常妇女月经周期中子宫内膜中的表达规律,并探讨其与生殖激素ER、PR,以及血管生成因子VEGF的关系。方法:采集于石家庄市第四医院生殖中心及白求恩国际和平医院生殖中心因输卵管性及(或)男方因素就诊月经规律符合纳入标准及排除标准的不孕患者40例,包括增生早期患者内膜标本7例,增生中期标本7例,增生晚期标本5例,分泌早期标本6例,分泌中期标本6例,分泌晚期标本9例。采用免疫组化法检测ER、PR、VEGF、Sphk1在正常妇女月经各个周期表达的规律。结果： 1患者一般资料比较:各子宫内膜分期患者组之间年龄、病程、BMI、b FSH间统计比较无明显差异(P>0.05),各组之间具有可比性。2子宫内膜不同时期ER、PR表达:ER增生早期腺体表达弱,主要呈现间质细胞表达;增生中期腺上皮细胞核表达增多;至增生晚期,腺上皮细胞核及间质细胞表达均明显增强(P<0.05)。分泌早期腺上皮细胞核及间质细胞ER表达较增生晚期降低(P<0.05);分泌中期内膜中ER在腺上皮细胞核表达降低,主要在胞浆中表达;分泌晚期腺上皮细胞核及间质细胞ER表达明显下降,较增生晚期、分泌早期表达具有统计学意义(P<0.05)。PR增生早期主要表现为间质染色,增生中期腺上皮细胞出现少量核染色,增生晚期腺上皮细胞核染色增强达到顶峰;分泌早期腺上皮及间质表达均增多;分泌中期PR表达强度降低,与分泌早期相比具有统计学意义(P<0.05),至分泌晚期表达降低甚至消失,与其余各期表达具有统计学意义(P<0.05)。3各组患者VEGF表达:VEGF蛋白在子宫内膜中主要表达定位于腺上皮细胞胞浆以及间质细胞及血管内皮细胞内。增生早中期,VEGF在腺上皮表达较弱,多数表达于间质细胞;增生晚期,腺上皮表达增多,差异较早中期具有统计学意义(P<0.05),间质细胞表达增强,差异无统计学意义(P>0.05)。分泌期VEGF表达逐渐增强,分泌中期VEGF在腺体及间质的表达显著高于其他各个时期(P<0.05)。4各组患者Sphk1表达规律:Sphk1主要表达于子宫内膜血管内皮细胞中,少量表达在腺上皮细胞胞浆及间质细胞中。增生早期表达低,增生中期表达较增生早期增高,具有统计学意义(P<0.05);增生晚期腺上皮胞质内含量表达增高,较增生中期有统计学意义(P<0.05)。整个增生期Sphk1蛋白表达低于分泌期(P<0.05),分泌期中晚期内膜中Sphk1表达高于增生中晚期(P<0.05),为周期中表达最强。5正常子宫内膜周期中Sphk1与ER、PR相关性分析:相关性分析显示,增生期ER、PR与Sphk1表达呈现正相关关系(r=0.839,P<0.01;r=0.877,P<0.01),分泌早中期ER、PR与Sphk1表达呈现负相关关系(r=-0.887,P<0.05;r=-0.858,P<0.01)。分泌晚期ER、PR表达降到最低,分泌晚期Sphk1表达较分泌中期下降,高于增生期。6正常子宫内膜周期内膜中Sphk1与VEGF的直线相关分析:子宫内膜腺上皮VEGF蛋白与Sphk1蛋白表达呈显著性正相关(r=0.938,P<0.01)。结论:1在正常妇女整个月经周期中均可在子宫内膜组织中检测到Sphk1蛋白的表达;2 Sphk1主要表达于子宫内膜血管内皮细胞中,少量表达在腺上皮细胞胞浆及间质细胞中;3 Sphk1在人类月经周期子宫内膜中的表达具有周期性,在围着床期表达达到顶峰,这种变化规律揭示Sphk1可能参与了子宫内膜容受性的建立,可作为预测子宫内膜容受性的分子指标之一;4 Sphk1的周期性表达受ER、PR等调节,并与VEGF表达呈正相关性,共同参与子宫内膜中的血管生成。第二部分补肾法、疏肝法对IVF-ET患者子宫内膜血流动力学的影响目的:观察补肾法、疏肝法对控制性超促排卵患者子宫内膜血流动力学以及妊娠结局的影响。方法:选取符合纳入标准及排除标准的因输卵管因素行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者113例。按照随机数字表法将入选患者随机分为补肾+西药控制性超排卵组(补肾组)30例、肾虚患者单纯应用西药控制性超排卵组(补肾对照组)28例;疏肝+西药控制性超排卵组(疏肝组)25例、肝郁患者单纯应用西药控制性超排卵组(肝郁对照组)30例。观察记录各组患者妊娠率;h CG日血清E2、P、LH水平;统计Gn使用天数及用量;h CG日子宫内膜厚度、类型;子宫动脉血流指数(RI、S/D、PSV、EDV);子宫内膜血流参数(VI、FI、VFI)等。结果： 1各组患者年龄、体重指数、窦状卵泡数以及基础促卵泡激素水平无统计学差异,具有可比性(P>0.05)。2各组患者注射h CG日血清E2、P、LH值比较:补肾组、疏肝组血清E2水平显著高于各自对照组,有统计学意义(P<0.05);各组之间血清LH、P水平差异无统计学意义(P>0.05)。补肾组、疏肝组各指标之间比较无统计学意义(P>0.05)。3 Gn使用天数、Gn总量的比较:各组之间Gn使用天数无显著性差异(P>0.05),疏肝组Gn总量实验组低于对照组,其差异有统计学意义(P<0.05)。补肾组Gn总量实验组低于对照组,但无统计学意义(P>0.05)。补肾组、疏肝组Gn使用天数、Gn总量比较无统计学意义(P>0.05)。4子宫内膜类型及厚度的比较:疏肝组中优质子宫内膜高于疏肝对照组,具有统计学差异(P<0.05),补肾组优质子宫内膜高于补肾对照组,差异无统计学意义(P>0.05)。子宫内膜厚度补肾调经方组、逍遥散组均高于各自对照组,有统计学意义(P<0.01;P<0.05)。补肾组子宫内膜厚度高于疏肝组,差异具有统计学意义(P<0.05)。5子宫动脉血流动力学参数比较:补肾组PSV值大于对照组,差异具有统计学意义;疏肝组h CG日子宫动脉RI低于疏肝对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。补肾组、疏肝组S/D比值均低于各自对照组,无统计学意义(P>0.05)。补肾组PSV值大于疏肝组,比较具有统计学意义(P<0.05),疏肝组RI低于补肾组,差异具有统计学意义(P<0.05)。各组之间EDV表达差异无统计学意义(P>0.05)。6子宫内膜血流动力学参数比较:补肾组子宫内膜VI值大于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01);疏肝组子宫内膜VI值大于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。补肾、疏肝两组VFI比值均大于各自对照组,差异无统计学意义(P>0.05)。补肾组、疏肝组比较无统计学意义(P>0.05)。各组之间FI值表达差异无统计学意义(P>0.05)。7子宫内膜容积比较:补肾组、疏肝组子宫内膜容积均较各自对照组增加,差异比较无统计学意义(P>0.05)。补肾组、疏肝组比较无统计学意义(P>0.05)。8妊娠数及妊娠率比较:补肾组妊娠20例,妊娠率66.67%;补肾对照组发生妊娠13例,妊娠率46.43%,两组之间妊娠率差异显著,有统计学意义(P<0.05);疏肝组妊娠18例,妊娠率72%;疏肝对照组发生妊娠14例,妊娠率46.67%,两组患者妊娠率差异显著,有统计学意义(P<0.05)。补肾组与疏肝组之间妊娠数、妊娠率比较无显著差异(P>0.05)。9并发症比较:补肾组生化妊娠1例;补肾对照组异位妊娠1例,胎停育1例;疏肝组异位妊娠1例;疏肝对照组生化妊娠1例,OHSS 1例。各组之间并发症发生率无统计学意义(P>0.05)。结论:1补肾调经方、逍遥散方能够增加IVF-ET患者妊娠率,改善其妊娠结局。2补肾调经方、逍遥散方均能够增加患者h CG日血清E2水平,增加子宫内膜厚度。疏肝组在改善超声下子宫内膜形态方面优于补肾组;补肾组在增加子宫内膜厚度方面优于疏肝组。在子宫动脉血流中,疏肝组降低RI优于补肾组,补肾组在改善PSV方面优于疏肝组。两方均能够改善子宫内膜血供,创造适宜胚胎着床的微环境。3补肾调经方、逍遥散方改善妊娠结局与其改善子宫内膜血供相关。提示中药补肾调经方、逍遥散方可以作为IVF-ET治疗的辅助用药。第三部分补肾法、疏肝法对Gn RHa控制性超促排卵大鼠子宫内膜容受性的影响目的:观察补肾法、疏肝法对Gn RHa控制性超促排卵大鼠子宫内膜内膜容受性的影响。方法:将80只动情周期正常SD大鼠随机分为正常组、模型组、补肾组、疏肝组各20只。除正常组外,各组大鼠造成Gn RHa控制性超促排卵模型(Gn RHa+HMG+h CG)。造模第一天始补肾组给予补肾调经方,疏肝组给予逍遥丸混悬液,1ml/200g/d灌胃,模型组及正常组同等剂量蒸馏水灌胃,连续11天。正常组腹腔注射同等剂量0.9%生理盐水。注射h CG日以雌雄比例2:1合笼,次日早9:00点观察阴栓,见栓记为G1天。至G5天大鼠断头取血,采用放射免疫法检测大鼠血清中雌二醇(E2)、孕酮(P)含量;HE染色观察大鼠子宫内膜形态的变化;免疫组化法检测子宫内膜雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR);电镜观察大鼠子宫内膜胞饮突表达;统计比较各组大鼠阴栓数、妊娠数、胚胎着床数。结果： 1大鼠阴栓率、妊娠率:与正常组相比,模型组大鼠阴栓数及妊娠数均下降,且胚胎着床数减少;与模型组相比,各治疗组阴栓数增加,统计学差异不明显(P>0.05),妊娠数及胚胎着床数增加,差异具有统计学意义(P<0.05),补肾组阴栓数、妊娠数及胚胎着床数较疏肝组增加,比较无统计学差异(P>0.05)。2观察各组大鼠用药后的一般状态:实验过程中,正常及各治疗组大鼠发育状态可,毛色白具有光泽,精神状况佳,体重增加明显。模型组大鼠活动较正常组少,有少许脱毛现象,体重增加较其余各组稍缓。用药期间未见明显不良反应。3各组大鼠动情周期的变化:正常组大鼠阴道涂片表现动情周期正常为4-5天,存在规律性动情周期变化。模型组及各治疗组大鼠在连续注射5天Gn RHa后阴道脱落细胞涂片表现为大量的白细胞,动情周期变化消失,均处于动情间期;注射h MG、h CG后大鼠动情周期变化基本恢复正常,h CG日大鼠阴道分泌物增多,阴道涂片镜下显示大量角化细胞,处于动情期。合笼后可见阴栓,涂片下可见精子。4各组大鼠性激素及其受体水平检测:与正常组比较,模型组血清P值降低,P/E2表达下降(P<0.05)。与模型组比较,补肾组、疏肝组血清P、P/E2表达增加(P<0.05)。各组间E2变化不明显,其差异无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠子宫内膜ER、PR表达较正常组降低;补肾组、疏肝组表达较模型组增加,有统计学意义(P<0.05)。补肾组、疏肝组之间表达无明显统计学差异(P>0.05)。5子宫指数检测:模型组子宫指数低于正常组、补肾组及疏肝组,差异具有统计学意义(P<0.01),补肾组、疏肝组子宫指数低于正常组,差异具有统计学意义(P<0.05),补肾组、疏肝组之间无明显统计学意义(P>0.05)。6子宫内膜表面胞饮突的变化:正常组大鼠子宫内膜表面均匀分布着大量边界清楚的膜状突起,分布均匀呈蘑菇状,为完全发育的胞饮突;模型组子宫内膜胞饮突数量较正常组减少,表面皱缩凹陷,呈现出退化表现;补肾组、疏肝组大鼠子宫内膜表面胞饮突数量较模型组增多,表面饱满,分布相对均匀。7大鼠子宫内膜厚度、组织形态、子宫内膜成熟度、螺旋动脉数量:模型组大鼠子宫内膜厚度较正常组低,各治疗组内膜厚度增加。子宫内膜成熟度模型组与正常组及各治疗组比较发育成熟度低(P<0.05)。补肾组与疏肝组比较,差异无统计学差异(P>0.05)。模型组大鼠子宫内膜螺旋动脉数量较正常组减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。各治疗组较模型组表达增高(P<0.05)。补肾组、疏肝组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1 Gn RHa控制性超促排卵中大量激素的使用影响SD大鼠子宫内膜容受性,妊娠率及胚胎着床率下降。2补肾调经方、逍遥丸能够改善大鼠血清E2、P及内膜ER、PR的表达,改善子宫内膜形态及胞饮突,从而提高妊娠率。3补肾调经方、逍遥丸在改善Gn RHa控制性超促排卵大鼠激素及受体调节、胞饮突表达方面区别不明显。第四部分补肾法、疏肝法对Gn RHa大鼠子宫内膜血管生成及血管通透性的影响目的:观察补肾法、疏肝法对Gn RHa控制性超促排卵大鼠子宫内膜血管生成及血管通透性的影响。方法:动物分组及造模同第三部分。采用免疫组化法和western blot法检测VEGF、Sphk1蛋白表达;逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)法检测VEGF m RNA、Sphk1 m RNA表达;用硝酸还原酶法检测大鼠血清以及子宫组织中NO、e NOS的表达。结果： 1子宫内膜VEGF定位及VEGF m RNA、蛋白表达:VEGF蛋白表达主要定位于子宫内膜腺上皮细胞、间质细胞以及血管内皮细胞的胞浆中,呈棕黄色颗粒。免疫组织化学、Western blot及RT-PCR等结果均为模型组子宫VEGF蛋白及其m RNA表达低于正常组(P<0.05,P<0.01);补肾组、疏肝组子宫VEGF蛋白及其m RNA表达较模型组增高(P<0.05),与正常组比较表达低(P<0.05)。补肾组、疏肝组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。2子宫内膜Sphk1定位及Sphk1 m RNA、Sphk1蛋白表达:Sphk1蛋白表达主要定位于子宫内膜血管内皮细胞的胞核及胞浆中,少量表达于腺上皮细胞、间质细胞,呈棕黄色颗粒。免疫组织化学、Western blot及RT-PCR等结果均表现为模型组子宫Sphk1蛋白及其m RNA表达低于正常组(P<0.01),补肾组、疏肝组子宫Sphk1表达较模型组增高(P<0.05)。3各组大鼠血清、子宫匀浆NO比较:与正常组相比,模型组大鼠血清、子宫匀浆NO含量下降。与模型组相比,补肾组、疏肝组大鼠血清、子宫匀浆NO含量升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与补肾组相比,疏肝组大鼠血清、子宫匀浆NO含量升高,具有统计学意义(P<0.05)。4各组大鼠血清、子宫e NOS比较:与正常组相比,模型组大鼠血清、子宫匀浆e NOS含量下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,补肾组、疏肝组大鼠血清、子宫匀浆e NOS含量升高,具有统计学意义(P<0.05)。补肾组、疏肝组之间大鼠血清、子宫e NOS比较无统计学意义(P>0.05)。5 Sphk1与VEGF相关性分析:Sphk1与VEGF含量两个变量之间有直线趋势,相关分析检测显示:Sphk1和VEGF的相关系数为0.865,P=0.000,有统计学意义。结论:1控制性超促排卵大鼠子宫内膜VEGF、Sphk1 m RNA及蛋白表达降低,血管生成不良。2控制性超促排卵大鼠子宫内膜血管舒张因子NO、e NOS表达降低,子宫内膜通透性降低。3 Sphk1与VEGF表达具有相关性,共同参与子宫内膜的血管生成。4补肾调经方、逍遥丸能够上调子宫内膜VEGF、Sphk1及NO、e NOS表达,提示补肾法、疏肝法能够通过增加子宫内膜血管生成及通透性改善子宫内膜容受性。其中,疏肝法上调血清及子宫匀浆中NO表达高于补肾法,提示疏肝法在改善内膜通透性方面优于补肾法。第五部分补肾法、疏肝法对Gn RHa控制性超促排卵大鼠子宫内膜Sphk1/S1P信号通路的影响目的:第四部分研究发现,补肾法、疏肝法具有增强子宫内膜Sphk1表达进而改善子宫内膜容受性的作用,本研究拟进一步探讨两法的具体作用机制和环节。方法:动物分组与取材同本课题第三部分。Sphk1、S1P1、Akt、p-Akt、Cyclin D1蛋白的表达:采用western blot法;Sphk1、S1P1、Akt、p-Akt、Cyclin D1m RNA:RT-PCR法。结果： 1 Sphk1 m RNA及蛋白表达:模型组与正常组相比,Sphk1表达降低(P<0.05);与模型组相比,补肾组、疏肝组Sphk1表达增高,有显著性差异(P<0.05)。补肾组、疏肝组表达较正常组Sphk1下降,差异无统计学意义(P>0.05)。补肾组与疏肝组比较差异无统计学意义(P>0.05)。2 S1P1 m RNA及蛋白表达:模型组与正常组相比,S1P1表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,补肾组、疏肝组S1P1表达增高,有显著性差异(P<0.05)。补肾组、疏肝组表达较正常组S1P1下降,差异有统计学意义(P<0.05)。补肾组S1P1表达较疏肝组增高,两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。3 Akt m RNA及蛋白表达:与正常组相比,模型组Akt表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,补肾组、疏肝组Akt表达增强,无统计学意义(P>0.05)。补肾组、疏肝组表达较正常组Akt下降,无统计学意义(P>0.05),补肾组与疏肝组比较差异无统计学意义(P>0.05)。4 p-Akt蛋白表达:模型组与正常组相比,p-Akt蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,补肾组、疏肝组p-Akt蛋白表达增强,有统计学差异(P<0.05)。补肾组、疏肝组表达较正常组p-Akt/Akt下降,差异有统计学意义(P<0.05)。补肾组表达较疏肝组增高,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。5 p-Akt/Akt表达:模型组与正常组相比,p-Akt/Akt表达降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,补肾组、疏肝组p-Akt/Akt表达增强,有显著性差异(P<0.05)。补肾组、疏肝组表达较正常组p-Akt/Akt下降,差异有统计学意义(P<0.05)。补肾组表达较疏肝组增高,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。6 Cyclin D1m RNA及蛋白表达:模型组与正常组相比,Cyclin D1表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,补肾组、疏肝组Cyclin D1表达增强,有显著性差异(P<0.05)。补肾组、疏肝组表达较正常组Cyclin D1下降,差异有统计学意义(P<0.05)。补肾组表达较疏肝组增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:补肾法、疏肝法能够增加Sphk1表达,激活PI3K/Akt信号转导通路,上调Cyclin D1表达,从而促进细胞增殖,发挥其改善子宫内膜容受性的作用。补肾法在提高S1P受体表达以及细胞增殖Cyclin D1方面优于疏肝法。