Human ether-a-go-go-related gene（hERG）编码的K⁺通道中介的快激活延迟整流K⁺电流(I_Kr)是包括人在内的大动物心脏动作电位3期复极化的主要电流成分,药物阻断心脏hERG钾通道致I_Kr减小是QT间期延长（LQT）从而引发心律失常的重要分子机制。小分子酪氨酸激酶抑制剂类（TKIs）抗肿瘤药物是目前新药研发热点,然而此类药物临床引发LQT,严重者可致尖端扭转性室性心动过速（TdP）、心源性猝死。离子通道电流的大小取决于通道动力学和细胞膜上功能通道的数量。膜通道蛋白的正向转运障碍和/或降解过程加速均可使膜通道蛋白数量减少而致电流减小。鉴于心肌细胞内酪氨酸激酶通过PI3K-SGK1信号通路对离子通道转录后的调节,我们推测,除直接阻断hERG钾通道和/或调节通道门控的急性作用外,TKIs很有可能通过抑制PI3K-SGK1信号通路、干扰hERG钾通道蛋白的转录后过程,导致膜h ERG通道蛋白表达量减少,进而抑制hERG电流,可能是TKIs造成LQT的重要原因。本实验选用临床引发LQT低风险的Erlotinib（Erl）、Imatinib（Ima）和高风险的Nilotinib（Nil）、Vandetanib（Van）四个TKIs抗肿瘤药物,在异源表达hERG通道的HEK293细胞和人诱导多潜能干细胞分化的心肌细胞（hiPS-CMs）验证以上假设。第一部分TKIs类药物致hiPS-CM细胞模型的心律失常作用。目的:为了考察近年提出的“体外综合评价模式（CiPA）”中人干细胞分化心肌细胞（hiPS-CM）模型是否可以敏感的检测TKIs的致心律失常作用。方法:使用Cardio-ECR实时监测同一孔区细胞加药前后,及加药不同时间点反映电生理改变的细胞场电位（Field potential,FP）及细胞收缩的影响。FP的考察参数为场电位振幅（Field potential amplitude,FPAmp）及场电位时程（Field potential duration,FPD）,收缩参数包括收缩幅度（Beating amplitude,BAmp）及收缩频率（Beating rate,BR）。当上述参数的波动百分变化率绝对值大于20%时,可以认定药物对细胞有影响。结果:1.Erl（1、10、100μM）作用于iPS-CM细胞24 h可浓度、时间依赖性降低FPAmp、BAmp、BR/FR,并延长FPD;四个参数的变化率绝对值均未达到20%且低、中、高三个剂量均未出现EAD及“notch”现象;说明此药对于iPS-CM细胞相对安全。2.Ima（1、10、100μM）各个时间点均未引起EAD及“notch”现象;中、高剂量作用12 h/24 h可使BAmp、BR/FR变化率绝对值均大于等于20%,即会使细胞收缩减弱,收缩频率加快,表明Ima具有抑制心肌收缩作用。3.Nil（0.1、1、10μM）作用于iPS-CM细胞24 h可浓度、时间依赖性降低FPAmp、BAmp、BR/FR,并延长FPD;中、高个浓度的多个时间点四个参数的变化率绝对值均超过20%且中浓度（1μM）作用12 h、24 h;高浓度（10μM）作用8 h、12 h、24 h均出现EAD及“notch”现象;说明此药对于iPS-CM细胞的安全性较低,易诱发心律失常及期前收缩。4.Van（0.1、1、10μM）作用于iPS-CM细胞24 h可浓度、时间依赖性降低FPAmp、BAmp、BR/FR,并延长FPD;中、高个浓度的多个时间点四个参数的变化率绝对值均超过20%且中浓度（1μM）作用4 h、8 h、12 h、24 h;高浓度（10μM）作用2 h、4 h、8 h、12 h、24 h均出现EAD及“notch”现象;说明此药对于iPS-CM细胞的安全性较低,易诱发心律失常及期前收缩。小结:1.在hiPS-CM细胞模型上,Erl、Ima均不显著影响细胞电生理参数,而Nil、Van随着作用时间的延长显著延迟细胞复极、诱发细胞产生“notch”及EAD现象。结果与临床报道药物诱发心律失常情况相一致。表明hiPS-CM模型可以敏感检测TKIs的致心律失常作用。2.Nil与Van都是在给药2 h以后出现EAD现象,而传统的hERG通道阻断剂E4031在给药后10 min内即出现EAD,提示我们TKIs还有另外的机制引发LQT。第二部分TKIs类药物对hERG钾电流的急、慢性作用目的:在异源表达系统上观察并比较四个TKIs药物对hERG钾电流急、慢性影响。方法:在稳态转染hERG通道的HEK293（hERG-HEK293）细胞上,全细胞膜片钳技术细胞外灌流四个TKIs类药物（每个药物6个浓度）,以给药10 min后（药理作用达稳态）尾电流下降幅值计算IC₅₀值。然后,慢性孵育药物24 h,与同批溶剂对照细胞相比较,观察四个TKIs类药物对hERG电流的慢性抑制作用。结果:1.四个TKIs类药物均呈浓度依赖性急性抑制hERG电流,经Hill拟合计算得到IC₅₀值分别为Erl:7.0μM;Ima:10.0μM;Nil:0.8μM;Van:0.8μM,显然Nil和Van的作用强于Erl和Ima。2.分别以上述IC₅₀浓度孵育药物24h后,与对照细胞相比电流均显著减小。绘制相同药物浓度下电流-电压曲线（以给药前或对照细胞做100%）,比较药物对电流的急、慢性抑制作用,发现两个低风险TKIs类药物Erl和Ima无显著差别,0 mV电压下Erl可分别使hERG电流降低至51.7%±3.0%和43.4%±2.6%,Ima分别为50.0%±3.5%、43.7%±2.6%;然而两个高风险TKIs类药物慢性孵育后较其急性抑制显著增强,Nil分别使hERG电流降低至52.6%±4.2%和31.5%±2.5%（P<0.05）,Van分别为51.7%±4.1%、31.1%±2.5%（P<0.05）。小结:四个TKIs类药物对hERG钾电流均具有急性阻断作用,其中Van、Nil的作用强于Erl和Ima;慢性孵育药物发现Van、Nil抑制电流作用较急性作用显著增强;四个TKIs的半数激活电压慢性作用较急性作用没有显著改变。以上实验结果提示我们TKIs对hERG电流的慢性抑制作用与通道动力学改变没有关系,而应与膜通道蛋白的数量有关系。第三部分TKIs类药物下调hERG钾通道的作用目的:考察四个TKIs类药物慢性作用对h ERG-HEK293细胞膜上155-kDa蛋白的影响;并借助工具药分析此类药物下调膜155-k Da蛋白的机制。方法:在h ERG-HEK293细胞上,慢性孵育四个TKIs类药物和/或工具药物24 h,提取全细胞蛋白,采用hERG抗体（可用于分别检测135-k Da非成熟型和155-kDa成熟型hERG通道蛋白）做western-blot,以155-kDa蛋白含量的变化反映四个TKIs对hERG细胞膜上功能通道蛋白的作用。结果:1.四个TKIs类药物在慢性孵育24h内呈时间依赖式降低成熟型155-kDa蛋白表达量;24 h时,可使155-k Da蛋白表达量分别显著降低至Control组的0.70±0.05倍（Erl）、0.65±0.04倍（Ima）、0.54±0.04倍（Nil）、0.50±0.05倍（Van）,两个高风险的TKIs类药物（Nil、Van）更为显著的降低了155-kDa蛋白表达量。选取Ima、Van进行以下实验分析成熟通道蛋白减少的分子机制。2.Brefeldin A（BFA）可以阻断细胞内功能蛋白的上膜过程,BFA（10?M）孵育细胞后不同时间Western blot测定155-kDa成熟蛋白表达量反映膜通道蛋白的动态降解。与单纯孵育BFA的对照细胞相比,Ima、Van均不同程度增加成熟蛋白降解,Ima 12 h、Van 4 h以后的作用更为明显。24h时,Ima、Van孵育细胞的155-kDa蛋白表达量分别是对照的0.78±0.05倍、0.47±0.03倍（P<0.05）。3.Dynosore（Dyn）可以阻断膜上功能蛋白的内化过程,抑制膜通道降解。与单独孵育Dyn（80?M）的细胞相比,Ima、Van孵育细胞后明显增加155-kDa蛋白表达量,尤以Van作用显著,24 h分别是对照的1.70±0.08倍（P<0.05）。结果进一步提示药物促进膜通道蛋白的内化、降解。小结:TKIs类药物慢性孵育可以通过加速膜蛋白的内化而减少膜155-kDa蛋白表达量,从而进一步抑制hERG电流。第四部分激活SGK1可对抗TKIs类药物的致心律失常作用目的:观察SGK1激活剂C4-ceramide（CER）对TKIs下调hERG通道155-kDa蛋白表达量及抑制h ERG电流的对抗作用;在iPS-CM细胞模型上验证我们前期的实验结果,考察SGK1激活剂CER对TKIs的致心律失常的对抗作用。方法:在hERG-HEK293细胞上,四个TKIs分别与不同剂量的CER（1、3、6μM）共同孵育24 h,提取全细胞蛋白,Western-blot检测155-kDa蛋白表达量;四个TKIs分别与CER共同孵育24 h,全细胞膜片钳技术记录hERG电流,观察CER对四个TKIs类药物抑制hERG钾通道功能的对抗作用。采用Cardio-ECR实时监测考察CER对高风险TKIs类药物致hiPS-CM细胞模型心律失常的对抗作用。结果:1.hERG-HEK293细胞单独孵育CER 24 h可显著增加155-kDa蛋白表达量;CER（1、3、6μM）与四个TKIs类药物共同孵育24h可浓度依赖性对抗TKIs类药物对155-kDa蛋白表达量的下调作用,Erl、Ima、Nil、Van分别与CER（6μM）共同孵育24h后使155-kDa功能蛋白表达量分别是对照的1.17±0.04、1.18±0.05、1.69±0.07、1.77±0.08倍（P<0.05）。2.CER（6μM）存在下,Erl、Ima在10⁵0 mV范围内略增加hERG尾电流密度,但没有显著差异;而Nil、Van在0⁵0 mV范围内显著增加尾电流密度,+50mV电压分别由对照的26.6±1.5pA/pF、26.1±2.5 p A/pF显著增加至50.0%±1.7 pA/pF、50.3±2.5 p A/p F（P<0.05）。3.CER与两个高风险的TKIs类药物Nil、Van共同孵育24 h,四个关键参数FPAmp、BAmp、BR/FR、FPD变化率的绝对值均小于20%,且各个时间点均未出现EAD现象。小结:SGK1激活剂CER可对抗TKIs慢性孵育后引起的膜hERG钾通道数量减少及对hERG电流的抑制作用,CER对两个高风险TKIs类药物作用尤为显著;在hiPS-CM细胞模型上,CER可以有效取消Nil、Van诱发的EAD现象。结论:1.TKIs类药物除了可以通过阻断hERG通道和/或调节门控急性抑制hERG电流外,尚可通过促时膜上成熟蛋白的内化、降解导致膜hERG通道蛋白膜表达量降低,进一步抑制hERG电流。2.在hiPS-CM细胞模型上,Erl、Ima均不显著改变细胞电生理参数,而Nil、Van随着作用时间的延长显著延迟细胞复极、诱发细胞产生“notch”及EAD现象。结果与临床报道药物诱发心律失常情况相一致。表明hiPS-CM模型可以敏感检测TKIs的致心律失常作用。3.SGK1激活剂CER可有效对抗TKIs慢性孵育后引起的膜hERG通道数量减少及对hERG电流的抑制作用。同时,在hiPS-CM细胞模型上,CER可以有效取消Nil、Van诱发EAD现象。以上结果表明,促进hERG膜通道蛋白降解是Nil、Van引发LQT从而产生心律失常的重要分子机制;而激活SGK1对其诱发心律失常具有对抗作用。我们的实验结果为TKIs潜在心律失常风险评价以及临床药物不良反应的防治提供了新思路。