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细菌外膜囊泡是革兰氏阴细菌分泌的脂双层球状小泡,它能够携带多种细菌毒力因子,将其转运到细菌胞外,或者进一步转运到宿主细胞中。因此,细菌外膜囊泡被认为是一种细菌转运毒力因子的重要方式。杀鱼爱德华氏菌是一种重要的鱼类病原菌,它在感染过程中,能够通过多种分泌系统将细菌毒力因子转运到宿主细胞内,干扰宿主的免疫防御系统,从而实现细菌的胞内感染和致病过程。为了探究杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡与细菌毒力因子转运的关系,本课题建立了杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡的提取工艺,筛选并鉴定了多个外膜囊泡转运型细菌蛋白因子,并进一步探讨了杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡的细胞内化机制及细菌毒力因子溶血素对其内化、胞内小泡运输及免疫识别的影响。具体内容包括:首先,通过超滤浓缩和密度梯度离心的方法建立了杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡的提取工艺,通过电镜观察了纯化外膜囊泡的形貌特征,考察了杀鱼爱德华氏菌在生长过程中产生外膜囊泡的时相变化,并通过SDS-PAGE初步分析了杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡的蛋白组分谱;接着,利用质谱技术对杀鱼爱德华氏菌的外膜囊泡蛋白进行了蛋白组分分析,鉴定获得了包括T3SS组件、T6SS组件、细菌铁摄取系统组件、溶血素等在内的细菌毒力因子。此外,我们还利用免疫印迹法从胞内转运的细菌蛋白因子中筛选获得多个依赖外膜囊泡分泌的细菌效应物;进一步,我们利用免疫荧光标记的方法考察了杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡内化进入宿主细胞的基本方式,并确定了其从早期内吞小泡至溶酶体的胞内小泡运输过程;最后,我们研究了溶血素对杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡在细胞内化及胞内小泡运输过程中的影响,表明溶血素不能影响杀鱼爱德华氏菌的细胞内化效率,但能够促进细菌外膜囊泡从早期内吞小泡中逃逸到胞质中,促进了 LPS被宿主caspase-4受体的免疫识别。综上可见,本课题筛选和鉴定了多种杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡转运型的细菌毒力因子,并探讨了溶血素对外膜囊泡内化、胞内小泡运输过程及宿主免疫识别的影响,为进一步深入研究杀鱼爱德华氏菌的感染致病机制奠定了基础。