日本血吸虫病是一种广泛流行的人兽共患寄生虫性疾病,导致严重的发病率和死亡率。尽管有一些抗血吸虫病的药物和公共卫生控制措施,血吸虫病并没有被控制,局部地区仍在扩散。在大多数病例中化疗能有效控制血吸虫病的病程发展,但流行区病人迅速的再感染需要反复的化疗。这不仅增加治疗成本,而且有引起耐药性的危险。因此,研制安全有效血吸虫病疫苗是长期综合防治血吸虫病的重要措施之一。自1990年Wolff报道编码外源蛋白的质粒DNA注射到小鼠的骨骼肌,外源蛋白能在骨骼肌中持续稳定的表达以来,抗血吸虫病疫苗进入核酸疫苗的新阶段。核酸疫苗相对于传统的致弱疫苗和亚单位疫苗具有低成本,热稳定性和能诱导广泛的体液和细胞免疫反应等优点。人们陆续制备出许多单价DNA疫苗,尽管可以产生特异性抗体和细胞毒性T淋巴细胞反应,但与致弱尾蚴产生的高保护力相比,单价DNA疫苗的免疫保护效果并不令人满意,至今还没有一商品化的疫苗问世。究其原因血吸虫是多细胞生物,基因组比细菌病毒复杂得多,且在与宿主长期进化的过程中产生了多种免疫逃避机制,所以单一的疫苗难以诱导出足够有效的保护力抵御攻击感染。发展多价疫苗是提高保护力的新策略,它具有多个保护性表位分子,能针对血吸虫不同种株和生活史中不同阶段的特异性抗原产生较好的保护力。本研究将不同的日本血吸虫抗原分子23kDa膜蛋白(Sj23)和脂肪酸结合蛋白(Sj14)引入到同一真核表达载体pVIVO2-mcs,构建双价共表达核酸疫苗,以期提高免疫保护效果。以BALB/c小鼠为动物模型观察了单价疫苗,共表达、融合表达双价疫苗、鸡尾酒混合双价核酸疫苗和四价疫苗的免疫保护效果,并初步以免疫剂量、免疫途径、免疫次数、末次免疫后攻击感染的时间四个因素探讨了双价疫苗的免疫优化方案。研究工作分为以下四个部分:一.日本血吸虫Sj23与Sj14的双价共表达DNA疫苗(pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23和pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14)的构建和鉴定以pVIVO2-IL12-Sj23和pVIVO2-IL12-Sj14为模板,根据Sj23、Sj14基因序列各设计2对引物,用PCR技术得到Sj23和Sj14的DNA片段。将这两个片段分别插入到真核表达载体pVIVO2-mcs的一个多克隆位点(BamHI/EcoRI),构建两个单价DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj23和pVIVO2-mcs-Sj14。与此类似,用含有不同酶切位点的另一对引物通过PCR技术得到Sj23和Sj14的DNA片段,经酶切后插入单价疫苗的另一个位点(AvrII/BspHI)上,构建双价DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23和pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14,酶切分析鉴定阳性克隆,并进行序列测定。结果:双酶切鉴定重组质粒pVIVO2-mcs-Sj23、pVIVO2-mcs-Sj14、pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14和pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23,所得小片段的大小分别是440bp和710bp。测序结果显示插入的cDNA片段与公布的Sj23或Sj14片段序列一致,提示质粒构建成功。华中科技大学生命科学院利用重组PCR技术将日本血吸虫Sj14和Sj23的基因片段用(Gly4Ser) 3进行连接,得到融合基因Sj14·Sj23和Sj23·Sj14,再将该片段重组于pVIVO2-mcs载体多克隆位点(BamHI/EcoRI)中,成功构建两种融合双价DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14,pVIVO2-mcs-Sj14·Sj23。与此类似,用含有不同酶切位点的另一对引物通过PCR技术得到融合基因Sj14·Sj23和Sj23·Sj14,经酶切后插入双价疫苗的另一个位点(AvrII/BspHI)上,成功构建两种四价DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14/Sj14·Sj23,pVIVO2-mcs-Sj14·Sj23/Sj23·Sj14。将pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14和pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14以等量混合,获得鸡尾酒混合疫苗。选用的载体pVIVO2-mcs是Invivogen公司新一代的具有两个翻译单位的双基因真核表达载体,由于真核表达载体具有人铁蛋白FerL和FerH复合启动子,可以消除两个转录单位的转录干扰。两个启动子的活性可进一步被SV40和CMV增强子增强。二.日本血吸虫Sj23与Sj14的双价共表达DNA疫苗(pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23)的真核表达在进行动物免疫接种前,必须确定构建的DNA质粒能够在真核细胞合成表达相应的目的抗原分子。为此,选取双价共表达DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23,观察其在体内外的真核表达。1.质粒pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23的体外瞬时表达采用脂质体转染技术将质粒pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23和pVIVO2-mcs进行体外瞬时转染HEK-293细胞,转染后48小时通过RT-PCR检测Sj14和Sj23 mRNA的表达,以间接免疫荧光法检测相应蛋白的表达。RT-PCR结果显示pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23转染后获得了440bp和710bp两条目的条带,间接免疫荧光染色显示部分转染细胞的胞膜和胞浆中有目的蛋白的表达。表明上述重组质粒能够在哺乳动物细胞中表达。2.质粒pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23在BALB/c小鼠体内骨骼肌细胞的表达及持续时间18只BALB/c小鼠随机分为两组,分别以pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23和pVIVO2-mcs质粒100μg/只经股四头肌免疫,免疫后4周、8周、12周、16周、20周、24周分别处死小鼠,取注射侧股四头肌做冰冻切片,间接免疫荧光定位显示免疫小鼠肌细胞的胞膜和胞浆均获得目的蛋白的表达,且表达持续6个月以上。三. DNA疫苗免疫保护力的观察120只5周龄雄性BALB/c小鼠随机分为12组,每组小鼠分别肌肉免疫下述DNA各100μg : pVIVO2-mcs, pVIVO2-mcs-Sj23, pVIVO2-mcs-Sj14, pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14, pVIVO2-mcs–Sj14/Sj23, pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14, pVIVO2-mcs–Sj14·Sj23, pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14/Sj14·Sj23, pVIVO2-mcs-Sj14·Sj23/Sj23·Sj14, pVIVO2-Sj23/Sj14+香菇多糖(100μg),鸡尾酒式混合疫苗(pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14与pVIVO2-mcs-Sj23.Sj14各50μg),对照组各鼠免疫生理盐水100μl。免疫后4周,每只小鼠经腹部皮肤感染40±2条日本血吸虫尾蚴,感染后6周剖杀,收集成虫计算虫荷均数并计算每克肝组织的虫卵数(EPG)。用TY70图像分析系统,测量肝脏切片中单卵肉芽肿直径(μm),以减虫率、肝减卵率和单个虫卵肉芽肿直径减小率评价各组质粒免疫保护力。实验结果:与空质粒相比,各实验组均有显著性免疫保护力(P<0.05)。双价疫苗组pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23, pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14, pVIVO2-mcs-Sj14·Sj23,鸡尾酒疫苗混合组和pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14+香菇多糖组免疫保护力显著高于单价疫苗组pVIVO2-mcs-Sj23和四价疫苗组pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14/Sj14·Sj23,pVIVO2-mcs-Sj14·Sj23/Sj23·Sj14(P<0.05),并且超过50%。pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14+多糖佐剂组免疫保护力最佳,获得68.89%的减虫率和84.04%肝减卵率。但四价疫苗组与空质粒对照组肝脏虫卵数无显著性差异,单价疫苗组,双价疫苗组间肝脏虫卵数无显著性差异(P>0.05)。减虫率超过50%的五组双价DNA疫苗组单卵肉芽肿直径的减小率18-39%,其中以融合双价疫苗组pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14效果最好。实验结果表明:双价DNA疫苗免疫保护效果较单价疫苗和四价疫苗好;在共表达、融合表达和鸡尾酒混合三种形式的双价DNA疫苗中,以鸡尾酒混合疫苗免疫保护效果最优,共表达、融合表达的双价DNA疫苗保护力无显著性差异;香菇多糖是DNA疫苗有效的佐剂。本次构建的单价,双价和四价疫苗均可有效的降低虫荷数,但不具备抗生殖能力,五组双价DNA疫苗可一定程度的减小虫卵肉芽肿直径,有一定的抗病理作用。四.日本血吸虫Sj23与Sj14的双价共表达DNA疫苗(pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23)免疫优化方案的研究为探讨最佳免疫条件,选取双价DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23进行第二次动物试验。应用SPSS12.0软件设计四因素三水平的免疫正交方案,通过统计学方法,以最少的实验组数获得与设置所有实验组相近的结果。四因素三水平分别是:免疫剂量(50μg、100μg、200μg)、免疫次数(1次、2次、3次,每次间隔2周)、免疫途经(肌内注射、背部皮下注射、尾根部皮内注射)、末次免疫后攻击感染的时间(4周、8周、12周)。110只5周龄雄性BALB/c小鼠随机分为11组,包括9个实验组和2个对照组(空质粒组、生理盐水组)。9个实验组用SPSS12.0软件按正交设计的原则,以四因素三水平表进行设计。两个对照组分别肌内注射100μg的pVIVO2-mcs和100μl的生理盐水,免疫后四周,每只小鼠经腹部皮肤感染40±2条日本血吸虫尾蚴,感染后6周剖杀,计算减虫率和每克肝脏减卵率。不同的实验组免疫时间不同,但11组小鼠攻击感染和剖杀时间一致。以减虫率和肝减卵率评价各组质粒免疫保护力。结果是9个实验组的成虫数和肝虫卵数均显著低于空质粒组和生理盐水对照组(P<0.05)。根据均值的结果分析:在四个因素三个水平的范围内,以免疫剂量50μg,免疫2次,皮内注射,末次免疫后12周攻击感染是较优化的的免疫方案。然而根据SPSS12.0的统计学分析,F< F临界值,即P>0.05,说明四个因素三个水平在统计学上无显著性差异(P>0.05)。本课题研究初步得出以下结论:1.成功构建两种单价DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj23,pVIVO2-mcs-Sj14和两种共表达双价DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14和pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23。2.双价DNA疫苗可以在体内外表达,且体内表达持续时间至少在6个月以上。3.适宜佐剂可增强抗原免疫力和维护免疫的回忆性效应,首次提出香菇多糖是DNA疫苗有效的佐剂,取得很好的结果,值得进一步研究。4.为提高DNA疫苗保护力,我们首先采用多价多位点的技术路线,以共表达、融合表达和鸡尾酒混合三种形式构建双价DNA疫苗,均可诱导小鼠产生较显著的抗血吸虫攻击感染的免疫保护力(有五组减虫率超过50%),保护作用显著高于单价DNA疫苗,无疑在多价疫苗的设计上提供了新的思路和依据。5.为提高DNA疫苗保护力,从免疫剂量、免疫次数、免疫途径、末次免疫后攻击感染时间四个因素个三个水平,探索和研究免疫优化方案。在统计学上,四个因素三个水平无显著性差异,但倾向于此范围内:50μg、免疫2次、皮内免疫和免疫12周后攻击感染为本次试验的最佳免疫方案。