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研究背景创面修复是一个复杂而又高度协调的过程,包括炎性反应、组织细胞增殖和组织重建三个互相重叠但又具有不同特点的阶段。由于血管能为创面修复提供氧气、营养和其它生物活性物质,因此,结构与功能兼备的成熟血管对创面愈合起到了至关重要的作用。单层内皮细胞互相连接,在形成血管管腔的同时,也构建了最基本的微血管屏障结构,这一屏障仅允许小分子物质通过血管壁进行物质交换,但阻碍白蛋白等大分子物质从血管内漏出。创面修复过程中,创面微血管有暂时性的结构破坏,渗漏增加的现象,但伴随着微血管结构和功能的重塑,创面渗漏逐渐停止,创面逐渐愈合;但是当创面微血管出现持续的异常渗漏,并因此造成创面水肿等现象时,则是创面愈合不良的标志,因此调节创面微血管通透性,抑制创面微血管持续的异常渗漏,具有重要的临床意义。本课题组曾采用GM-CSF基因敲除小鼠的创伤修复模型,以及糖尿病小鼠创面模型对GM-CSF促进创面愈合的机制进行了研究,结果证实GM-CSF能促进创伤愈合,并对创面的新生血管化具有重要的调控作用。本研究在前期实验结果的基础上,利用小鼠创面模型检测创面微血管通透性,结果发现GM-CSF可有效维护血管屏障的完整性,减少创面渗出。结合既往的文献报道证实Ang-1是一类重要的调节血管通透性的分泌型细胞因子,能够减少血管通透性,维护血管稳定。由此我们提出假设:创伤修复中可能存在“GM-CSF-血管周细胞上调Ang-1的表达-调节微血管通透性”这样的机制。为了验证这一假设,我们将采用小鼠创面模型和内皮细胞/血管周细胞共培养体外模型,观察小鼠创面的微血管渗漏情况及体外共培养条件下内皮细胞的通透率,此外还将对GM-CSF调节创面血管通透性的相关信号通路做初步探讨和验证。我们的研究对于创面愈合具有一定的临床意义,有助于进一步完善创伤修复过程中分子生物学机制的理论,并可望将血管周细胞（Ang-1）作为干预的目标来提出新的治疗思路。研究方法1.动物实验验证GM-CSF对创面愈合过程中的微血管渗漏具有调节作用。首先制作小鼠背部全层皮肤缺损创伤模型（1.0x1.0cm2）,随机分组并在创面上分别外用GM-CSF凝胶（金扶宁）和不含GM-CSF的基质胶,每天拍照记录创面愈合情况,并用imageJ软件统计计算创面愈合率。创面愈合率（%）=（第n天的创面面积-第0天第创面面积）?第0天的创面面积×100%,n=0,3,5,7,10和14。此外,在创伤后第3,5,7,10和14天,将Evans blue（0.5%（w/v）,0.2 ml）经尾静脉注射,以检测创面局部微血管的渗漏情况,注射60分钟后拍照记录创面及创周蓝色染料弥散沉积的情况。随后,将创面及距离创缘5mm处的正常皮肤组织取下,称重并浸入DMF溶液中,分光光度计读取620nm波长处的O.D值,定量分析Evans blue渗出量。判断GM-CSF能否对创面愈合率及创面愈合过程中的微血管渗漏有调节作用。2.体外验证GM-CSF在血管周细胞存在的条件下对单层内皮细胞通透性的影响作用。采用内皮细胞单独培养和内皮细胞/血管周细胞共培养两种体外细胞模型,模拟体内的微血管屏障。在使用VEGF诱导内皮细胞通透性增加的前提下,比较GM-CSF在不同模型条件下,对单层内皮细胞通透性的影响,分析血管周细胞是否能通过旁分泌作用,调节微血管通透性;以及GM-CSF是否影响血管周细胞对微血管通透性的调节作用。细胞免疫荧光检测细胞间连接蛋白的表达和分布,对GM-CSF调节单层内皮细胞通透性的潜在机制进行探索。3.体内、外实验验证GM-CSF促进血管周细胞增强Ang-1的分泌。在小鼠创面模型建立后,随机分组并分别外用金扶宁和基质胶,在第3,5,7,10和14天,取小鼠背部创面及创缘皮肤,制作成冰冻切片,用荧光标记的Ang-1抗体检测小鼠创面Ang-1的表达。其次通过组织免疫荧光共染的方法,同时标记NG2（血管周细胞标志）抗体和Ang-1抗体,检测血管周细胞和Ang-1的相互关系;体外血管周细胞培养实验中,在第0,3,6,12,24小时,收集经GM-CSF（10ng/mL）刺激的血管周细胞的上清液,采用ELISA方法检测分泌型蛋白Ang-1的表达。同时抽提细胞mRNA,采用Real time-PCR方法检测Ang-1的基因表达。4.采用RNAi技术抑制Ang-1的表达,以此验证Ang-1是介导GM-CSF调节血管通透性的主要细胞因子。体外实验中设计4组siRNAAng-1,将其转染血管周细胞,48小时后采用WB和RT-PCR方法检测各组的Ang-1蛋白和基因的表达量,筛选出最有效的一组siRNAAng-1,用于后续的功能检测。在细胞共培养模型中,接种转染siRNAAng-1的血管周细胞,检测Ang-1的表达抑制对GM-CSF调节单层内皮细胞通透性的影响,判断Ang-1是否具有重要的介导作用。体内实验中,按文献提供方法制备含siRNAAng-1的pluronic凝胶,外用于小鼠创面,隔日一次,在第5天收集创面提取蛋白,采用WB方法检测Ang-1的蛋白表达,以明确siRNAAng-1转染的有效性。小鼠创面隔天交替外用siRNA的凝胶和GM-CSF凝胶,于第5天采用Evans blue法检测创面的渗出情况,判断Ang-1是否介导了GM-CSF调节创面微血管通透性。5.对GM-CSF促进血管周细胞分泌Ang-1,从而参与调节血管通透性的信号通路进行初步的探索。由于JAK2/STAT5信号通路是GM-CSF作用于受体后激活的一个主要的信号通路,因此,我们采用WB技术,检测GM-CSF刺激下血管周细胞的pJAK2和total JAK2蛋白的表达。此外还将采用JAK2抑制剂预处理血管周细胞,并检测Ang-1蛋白的表达。由此,初步判断GM-CSF是否通过JAK2/STAT5信号通路,刺激血管周细胞表达Ang-1。研究结果1.外用GM-CSF凝胶能有效促进小鼠创面的愈合（较对照组愈合速度快近10%）;并且可以明显减少小鼠创面的微血管渗出。Evans blue定量分析结果显示,与GM-CSF组相比,对照组的小鼠创面Evans blue渗出量最高可达前者的1.4倍。2.GM-CSF可以降低由VEGF诱导产生的内皮细胞血管通透性的增加。建立体外共培养模型模拟在体微血管屏障,在VEGF诱导增加内皮细胞通透性的前提下,GM-CSF可以使得内皮细胞单独培养模型中的单层内皮细胞的通透性下降69%,这一作用在共培养体系中更明显（通透性下降78%）;进一步的细胞免疫荧光检测细胞间连接蛋白PECAM-1的结果显示,GM-CSF有效“阻止”了VEGF“打开”内皮细胞间的“gap”,使得内皮细胞间的连接更紧密。3.GM-CSF能够刺激血管周细胞分泌Ang-1。动物创面模型中,第7天的小鼠创面皮肤组织的免疫荧光检测显示,与对照组相比,GM-CSF凝胶处理组的小鼠真皮表达更多的Ang-1蛋白,并且当同时用NG2标记血管周细胞时,Ang-1的表达与NG2标记的血管周细胞表达呈现较为密切的相关性,即考虑血管周细胞是分泌型蛋白Ang-1的主要细胞来源。体外实验中,血管周细胞培养的上清液检测,Ang-1蛋白的分泌峰值在GM-CSF刺激后第6小时出现,后逐渐下降至稳定水平（第24小时）。而上清液中的VEGF表达量,在GM-CSF的作用下未有明显改变。4.采用RNAi技术抑制Ang-1的表达,在体外有效转染血管周细胞后,siRNAAng-1使内皮细胞/血管周细胞共培养模型中的内皮细胞通透性上升1.7倍(与同模型中GM-CSF+siRNA NC处理组比较),减弱了GM-CSF抑制内皮细胞通透性的作用;在小鼠创面外用含有siRNA Ang-1的凝胶后,同样使得GM-CSF对小鼠创面微血管完整性的保护作用减弱,第5天小鼠创面Evans blue定量分析显示,对比siRNA NC凝胶外用组,siRNA Ang-1凝胶的使用使得Evans blue的渗出量增加了1.3倍。5.Western Blot技术检测显示GM-CSF可以刺激血管周细胞分泌Ang-1,并且激活GM-CSF受体下游的JAK2,使JAK2发生磷酸化;JAK2抑制剂的使用则减少了GM-CSF刺激下Ang-1的表达。即GM-CSF上调血管周细胞分泌Ang-1是JAK2依赖的。研究结论GM-CSF可以通过诱导血管周细胞分泌Ang-1,从而减少微血管的渗漏,调节微血管通透性。GM-CSF调节创面微血管通透性,维护血管稳定性的作用,是对创面愈合机制的补充,具有一定的临床指导意义。