研究背景肝郁脾虚证指由于肝气郁结,疏泄失司,导致脾胃功能紊乱,出现肝木克脾土的情况,表现为消极、适应能力低下、泄泻、体重降低、饮食减少等。现代生活节奏的加快,工作压力、社会竞争、起居调摄失宜等原因,造成人们心里负荷加重,情志抑郁,气机失于调达,而致肝郁脾虚证成为临床的常见证候。随着生物—心理—社会医学模式的建立,肝郁脾虚证在各种疾病的发生发展中的重要作用也逐渐被认识到,因此对于肝郁脾虚证的研究也得到了进一步的关注。长期以来,中医研究者们一直试图从多系统、多层次、多角度来诠释肝郁脾虚证的实质,挖掘其临床变化的物质基础。通过多年的研究和探索发现肝郁脾虚证的发生和应激密切相关[1],且海马和前额皮质是应激过程中的易感脑区[2]。长期暴露于应激状态下,使HPA轴脱抑制,糖皮质激素维持在较高水平,使海马和前额皮质(Prefrontal cortex,PFC)脑区受损,胶质细胞变性、锥体细胞萎缩、突触蛋白PSD95和突触蛋白Ⅰ表达下调,而这些改变均与PFC的认知功能损害相关[3]。机体应激可以使糖皮质激素水平升高,同时脑中谷氨酸水平也随之大幅升高。谷氨酸浓度和作用时限超出生理范围,则会导致兴奋性神经毒性的产生,损伤神经元。这就是社会应激如致情感障碍的病理机制之一。这一机制与长期应激导致的星形胶质细胞(Astrocyte,As)损伤及兴奋性氨基酸转运体(Excitatory Amino Acid Transporters,EAATs)功能障碍相关。研究证实[4],突触间隙约80%~90%的兴奋性氨基酸的转运全部依赖As、EAAT1和EAAT2来完成,因此As在维持突触间隙谷氨酸浓度和抑制兴奋性氨基酸毒性中发挥了重要作用。另外有研究表明,获得性无助应激可以使大鼠海马和皮层的EAAT1和EAAT2表达显著减少[5]。综上所述,长期应激可致As损伤及EAATs功能障碍,不能对应激诱导的突触间隙中谷氨酸进行抑制,诱发兴奋性氨基酸毒性,破坏神经元可塑性。研究发现慢性应激可导致动物前额皮质区星形胶质细胞密度降低[6],另外有研究表明慢性不可预见性应激可使小鼠前额皮质胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary protein,GFAP)蛋白表达减少[7-9]。胶质细胞数目和形态的改变与胶质细胞功能损伤可能互为因果,且应激又可导致GFAP表达减少。从而提示前额皮质区星形胶质功能受损可能参与长期慢性应激导致的肝郁脾虚证的发生,但是关于肝郁脾虚证的这一机制研究目前尚无相关报道。研究目的本研究对长期慢性复合应激诱导的肝郁脾虚证小鼠前额皮质星形胶质细胞谷氨酸调节功能变化及逍遥散的治疗机制进行了研究,以期为肝郁脾虚证的实质和其生物学内涵的诠释奠定基础,为肝郁脾虚证的治疗寻找新的药物作用靶点。研究方法1.实验选用成年C57BL/6J雄性小鼠80只,10周龄,随机分为正常组,模型组,逍遥散组和氟西汀组,每组20只。正常组5只1笼,其余3组单笼孤养。2.适应性喂养7天后,除正常组外,其余各组小鼠均以复合应激方法制作21天肝郁脾虚证小鼠模型,同时模型组、逍遥散组和氟西汀组小鼠分别进行生理盐水、逍遥散和氟西汀灌胃干预。3.对小鼠体重、摄食量及宏观表征进行观察和记录。4.以旷场实验、高架十字迷宫实验、新环境抑制进食实验、强迫游泳实验和糖水实验对小鼠的行为学进行评价。5.比色法检测小鼠血清D-木糖含量的改变。6.HE染色观察小鼠前额皮质病理改变。7.ELISA方法检测小鼠前额皮质b FGF、TGF-β1、BDNF和NGF的含量。8.比色法检测小鼠前额皮质谷氨酸(Glu)浓度。9.Western Blot和免疫组化方法检测小鼠前额皮质GFAP、Neu N、EAAT1和EAAT2蛋白的表达。10.Quantitative Real-time PCR(q PCR)方法检测小鼠前额皮质中的GFAP、Neu N、EAAT1和EAAT2基因的表达。11.尼氏染色观察小鼠前额皮质神经元形态和数目。研究结果1.各组小鼠一般情况比较:模型组小鼠表现由易怒转变为低落,毛发凌乱无光泽,扎堆少动,灌胃抵抗弱,便溏。氟西汀组和逍遥散组上述反应较轻,而正常组未见明显异常表现。各组小鼠体重增长存在显著差(P<0.01),模型组和逍遥散组小鼠体重增长缓慢(P<0.01),而氟西汀组小鼠体重增长速度介于正常组和模型组之间。各组小鼠摄食量差异显著(P<0.01),模型组小鼠摄食量显著减少(P<0.01),而氟西汀和逍遥散组摄食量较模型组显著增加(P<0.05)。2.行为学检测结果比较:强迫游泳实验发现模型组5 min内不动时间显著增加,氟西汀和逍遥散组5 min内不动时间较模型组显著减少(P<0.05)。旷场实验提示模型组中央区进入次数和停留时间较正常组显著减少(P<0.01),而氟西汀和逍遥散组中央区停留时间较模型组显著减少(P<0.05),且总运动距离较模型组显著增加(P<0.05)。高架十字迷宫实验显示,模型组开放臂停留时间比例较正常组显著减少(P<0.01),逍遥散组开放臂停留时间比例较模型组显著增加(P<0.05)。各组小鼠糖水偏好差异显著(P<0.01),模型组糖水偏好显著小于其他三组(P<0.05)。3.血清D-木糖含量比较:模型组血清D-木糖较正常组和逍遥散组显著减少(P<0.05),而氟西汀组血清D-木糖较模型组无显著差异(P>0.05),较逍遥散组显著减少(P<0.05)。4.HE染色显示:模型组小鼠前额皮质Pr L区组织细胞出现排列紊乱,胞体缩小,胞浆浓缩红染,核膜核仁分界不清,异染色质较多,核皱缩深染等病理表现,而逍遥散组和氟西汀组上述改变明显减轻。5.ELISA检测显示:模型组BDNF和NGF含量显著减少(P<0.05),另外模型组和氟西汀组b FGF含量显著升高(P<0.01),且逍遥散和氟西汀组NGF含量较模型组显著增加(P<0.05)。6.比色法检测显示:模型组小鼠前额皮质谷氨酸浓度显著增加(P<0.01),逍遥散和氟西汀组谷氨酸浓度较模型组显著降低(P<0.01)。7.免疫组化检测显示:模型组小鼠前额皮质GFAP、EAAT1、EAAT2蛋白阳性细胞数和OD值均显著下降(P<0.01),且Neu N蛋白OD值显著下降(P<0.01);逍遥散组GFAP、EAAT1和EAAT2蛋白阳性细胞数和OD值,及Neu N蛋白OD值较模型组均显著上升(P<0.05);氟西汀组EAAT2蛋白阳性细胞数和OD值、EAAT1、GFAP、Neu N蛋白OD值较模型组均显著上升(P<0.05)。8.Western Blot检测显示:模型组小鼠前额皮质中GFAP、Neu N、EAAT1和EAAT2蛋白的表达均显著下降(P<0.01),逍遥散组GFAP、EAAT1和Neu N蛋白表达较模型组显著上升(P<0.05),而氟西汀组GFAP、EAAT1、EAAT2和Neu N蛋白表达较模型组均显著上升(P<0.05)。9.q PCR检测显示:模型组小鼠前额皮质中的EAAT2基因表达显著下降(P<0.01),GFAP、EAAT1和Neu N基因表达虽存在下降趋势,但与正常组比较无显著差异,逍遥散组GFAP、EAAT1、EAAT2和Neu N基因表达较模型组均显著增加(P<0.05),氟西汀组Neu N和EAAT2蛋白表达较正常组和模型组显著增加(P<0.05),另外EAAT1和GFAP基因表达较模型组显著增加(P<0.05)。10.尼氏染色显示:模型组神经元数量显著减少(P<0.01),逍遥散组和氟西汀组神经元数量较模型组显著增加(P<0.05);另外,模型组小鼠前额皮质神经元出现排列紊乱、缺失、损伤明显、形态不规则、核边界模糊、分布不均匀等病理表现,逍遥散组仅有少量神经元形态不规则,而氟西汀组较正常组未见明显异常。研究结论1.根据各组小鼠宏观表征、各行为学表现、血清D木糖含量以及“以方测证”理论综合判定,本研究采用复合应激方法制作小鼠肝郁脾虚证模型的初步尝试是成功的。2.根据肝郁脾虚证模型小鼠前额皮质组织形态的改变、GFAP蛋白和基因表达减少、以及相关神经生长因子含量如BDNF、NGF、TGF-β1和b FGF含量改变等研究结果,可综合判定肝郁脾虚证模型小鼠前额皮质星形胶质细胞功能有一定程度的损伤。3.根据肝郁脾虚证模型小鼠前额皮质EAAT1和和EAAT2蛋白和基因的表达减少,以及前额皮质谷氨酸浓度大幅增加的研究结果,可判断肝郁脾虚证小鼠前额皮质谷氨酸循环障碍,此病理改变与其前额皮质星形胶质细胞功能障碍密切相关。4.根据肝郁脾虚证小鼠前额皮质Neu N蛋白和基因表达减少,神经元数量减少及形态紊乱等研究结果可判断肝郁脾虚证小鼠前额皮质神经元功能和形态均受到一定程度的损伤,此病理改变与星形胶质细胞功能减弱导致前额皮质谷氨酸浓度大幅度增加有着密切的联系。5.逍遥散可通过改善肝郁脾虚证小鼠前额皮质组织病理改变、上调GFAP蛋白和基因的表达、调节相关神经生长因子的含量、增加EAAT1和EAAT2蛋白和基因的表达、降低前额皮质谷氨酸含量、增加Neu N蛋白和基因的表达,改善神经元形态和数量等达到治疗肝郁脾虚证的目的。