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研究目的：全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌,是全球范围内女性最常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌的发病与雌激素水平及遗传有关。已被证实一些基因与乳腺癌发生发展密切相关如ERα、HER2、VEGF等。目前根据乳腺癌组织雌激素受体及HER2基因扩增等情况将乳腺癌分为不同的分子类型,并给与不同的治疗方案如内分泌治疗及抗HER2基因的药物赫赛汀。乳腺癌的内分泌治疗是雌激素受体阳性乳腺癌患者综合治疗的重要部分,主要包括拮抗雌激素受体的他莫昔芬、托瑞米芬和芳香化酶抑制剂如阿那曲唑等,以及下调雌激素受体药物氟维司群。他莫昔芬是应用最早的内分泌治疗药物,广泛应用雌激素受体阳性的乳腺癌患者中。他莫昔芬术后辅助治疗5年明显改善了早期乳腺癌的生存期,目前已推荐10年他莫昔芬治疗。然而,无论雌激素受体情况如何,很多患者最后出现他莫昔芬耐药,约35%的患者出现他莫昔芬治疗失败。他莫昔芬耐药已经成为乳腺癌复发及进展的原因之一,而导致耐药的机制未知,并成为困扰临床的一个重要问题。乳腺癌内分泌治疗耐药与一些原癌基因激活、抑癌基因失活有关。HER2基因扩增与他莫昔芬耐药有关。MTDH是新发现的一个多功能癌基因,在多种恶性肿瘤组织包括乳腺癌中过度表达。MTDH参与调节PI3K/AKT、NF-kB等多条信号传导通路,在肿瘤细胞的浸润、远处转移以及肿瘤血管生成过程中发挥着重要的促进作用。EMT(上皮间质转化)与肿瘤细胞变异及侵袭性有关,研究发现MTDH可以通过诱导EMT而促进乳腺癌细胞转移与侵袭。在与乳腺癌的相关免疫组化研究结果显示乳腺癌患者术后肿瘤标本中检测MTDH基因,大约40%的肿瘤组织检测到MTDH基因的过表达,并且与乳腺癌的高度侵袭性的不良的预后密切相关。MTDH还是一个与药物耐药有关的基因,可介导多种化疗药物耐药如5-FU,多柔比星。但MTDH是否影响内分泌治疗药物他莫昔芬的敏感性尚不明确。本实验拟通过基因转染技术转染MCF-7乳腺癌细胞,筛选MTDH基因过表达的细胞系,并通过体内及体外实验研究MTDH基因过表达后肿瘤细胞对雌激素依赖性及他莫昔芬敏感性的影响,并探讨其发生机制。研究方法：为了检测MTDH在不同细胞系的表达情况,我们应用RT-PCR方法在RNA水平上对ERa阴性的细胞系MDA-MB-231,MDA-MB-468and ERa阳性的细胞系MCF7and T47D检测MTDH的表达情况。检测的4个细胞系均不同程度表达MTDH,其中MDA-MB-231表达量最高,MCF7表达量最低。我们选择ERa阳性的细胞系MCF7作为研究MTDH与激素依赖性和他莫昔芬敏感性的细胞系。首先,根据pcDNA3.1载体的说明书构建MTDH过表达载体,然后分别用已构建成功的过表达载体(3.1m)及对照的空载体(3.1n)转染人乳腺癌MCF-7细胞系,用不同浓度6418筛选约一个月,得到稳定表达MTDH基因的细胞系3.1-m及相对应的表达空载体的细胞系3.1-n。用实时定量PCR在mRNA水平及western blot在蛋白水平检测已筛选出细胞系中MTDH基因的过表达效率。细胞筛选成功后,用MTT法检测MTDH过表达与空载体细胞的雌激素依赖性情况,根据两组细胞在不同浓度雌激素及有无雌激素的作用下的生长情况来评价细胞对雌激素的依赖性。MTT法检测肿瘤细胞活性,绘制生长曲线,分析细胞对于不同浓度的雌激素刺激和有无雌激素条件下的增殖能力的变化,评价MTDH过表达后MCF-7细胞的激素依赖性,并运用统计学分析其差异性。应用裸鼠皮下成瘤实验来测量瘤体的大小,评价肿瘤细胞的皮下成瘤能力,在体内进学意义。我们把这两组细胞分别在有无雌激素的条件下培养,结果表明在无雌激素的情况下,MTDH过表达的细胞MCF7-3.1m增殖活性明显高于MCF7-3.In.体内实验,裸鼠皮下成瘤结果显示MTDH过表达使MCF-7细胞在无雌激素的情况下成瘤能力增强,而对照组几乎不能成瘤,差异显著,进一步证实MTDH过表达促进MCF-7细胞雌激素非依赖性生长。我们通过对两种肿瘤细胞给与不同浓度的他莫昔芬,应用MTT法和克隆形成实验检测肿瘤细胞对他莫昔芬的敏感性,结果表明在经过他莫昔芬作用后MTDH过表达细胞的细胞增殖能力和克隆形成能力均较对照组细胞增强,结果提示为对他莫昔芬耐药。我们通过检测调亡探讨MTDH引起他莫昔芬耐药的机制。用含有10uM他莫昔芬的培养液处理肿瘤细胞,作用24小时后检测两种细胞的调亡比例。结果表明MCF7-3.1m细胞的调亡率为13%,明显低于MCF7-3.In细胞的18%,差异显著,表明MTDH可以抑制他莫昔芬所致的细胞凋亡。为进一步探讨MTDH引起他莫昔芬耐药的通路,我们应用Western blot检测ERα、P-AKT、BCL-2和PTEN的表达情况,结果表明MCF7-3.1m细胞的ER α表达与MCF7-3.In细胞无显著性差异,p>0.01.MTDH可以上调P-AKT和BCL-2的表达而使PTEN下调38%。结果提示MTDH引起的他莫昔芬耐药是通过抑制PTEN的表达进而激活P-AKT所致。为了进一步阐明MTDH引起他莫昔芬耐药的机制,我们抑制MCF7-3.In细胞的PTEN的表达,然后应用MTT法分析对他莫昔芬的敏感性和western blot法检测P-AKT的表达。干扰PTEN的表达导致MCF7-3.lnsiPTEN细胞对他莫昔芬敏感性下降,western blot结果显示P-AKT的表达水平上调。抑制PTEN的表达没有引起ER α和BCL-2表达水平,因此我们得出结论MTDH通过调节PTEN/PI3K/AKT通路引起雌激素非依赖性生长和他莫昔芬耐药。结论1.MTDH能够介导雌激素受体阳性乳腺癌细胞MCF-7的雌激素非依赖性生长和他莫昔芬耐药；2. MTDH能够抑制PTEN的表达,上调AKT和BCL-2并抑制他莫昔芬所致的细胞凋亡；3. MTDH通过调节PTEN/AKT通路引起的他莫昔芬耐药。意义1.研究了MTDH对内分泌治疗药物他莫昔芬敏感性的影响及产生影响所经通路；2.在乳腺癌中研究了MTDH与激素依赖性的关系；3. MTDH基因可作为雌激素受体阳性乳腺癌他莫昔芬敏感性的预测因子。