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新生血管的形成对于原发肿瘤或癌症的生长和持续至关重要。血管生成的诱导先于恶性肿瘤的形成,血管化的增强与肿瘤的侵袭性有关。因此,研发干扰肿瘤血管生长的抑制剂,有望为控制肿瘤生长提供新策略。金纳米颗粒(Gold nanoparticles,AuNPs)具有良好生物相容性、易合成、毒性较小等特点,被认为是治疗癌症的理想药物载体。此外,研究表明AuNPs具有调控血管生成的功能。然而,这些研究主要以培养细胞为对象,无法模拟体内血管生成环境。利用实验动物建立的体内血管模型也无法进行实时观察和追踪。鸡胚尿囊绒毛膜(Chorioallantoic membrane,CAM)是禽类胚胎发育所需的高度血管化的组织,可以真实模拟体内血管的发育,是研究血管生成的重要体内模型。但是,由于蛋壳的存在,也限制了血管的可视化和实时追踪,无壳培养体系的建立有助于突破这一障碍。为此,本研究通过筛选无壳培养体系的预孵时间、转蛋方法、培养介质和通气时间等,优化鸡胚无壳培养条件,建立了鸡胚无壳培养体系。利用无壳鸡胚CAM血管模型,探讨了AuNPs对血管生长发育的影响,为解析血管发生机制,研发抗血管治疗癌症新策略奠定了基础。试验一鸡胚无壳培养体系的建立针对无壳培养鸡胚的早期发育难以启动和中期容易出现缺氧等问题,本研究通过探讨不同预孵时间对鸡胚转蛋成功率和存活率的影响,以及不同通氧时间对低氧诱导因子(Hypoxic inducing factor,HIF-1α)mRNA和蛋白的表达,优化了鸡胚无壳培养的条件,并对无壳鸡胚心血管系统的发育和孵化后雏鸡的生长发育进行评估,旨在建立高效稳定的无壳培养体系。结果表明:(1)37.8℃预孵48 h及48 h以下,转蛋后的鸡胚完整度和转蛋成功率极显著高于37.8℃预孵72 h的处理组(P<0.01),预孵48 h的鸡胚在转蛋后5 d内的存活数量极显著高于其他三个处理组(P<0.01);(2)第8 d打孔通气处理组的鸡胚死亡率极显著低于其他通气处理组(P<0.01),未通气时第8 d鸡胚的HIF-1αmRNA和蛋白表达水平极显著高于第7 d鸡胚(P<0.01),通气后HIF-1α的水平极显著降低(P<0.01);(3)无壳培养鸡胚心脏的形态与正常孵化鸡胚无明显差别,且两者的GATA 4、VEGF和FGF的mRNA和蛋白水平无显著性差异(P>0.05);(4)采用37.8℃预孵48 h和第8 d通气的培养体系,在21 d时可获得47.67±1.05%的孵化率;(5)无壳培养孵化鸡的形态与正常孵化鸡无明显差别,两者的增重差异不显著(P>0.05),且无壳孵化鸡具有正常的繁殖机能。因此,宜采用37.8℃预孵48 h、第8 d打孔通气的条件进行无壳培养体系的构建。试验二AuNPs对无壳培养体系鸡胚CAM血管生成的影响以无壳培养鸡胚CAM血管为模型,采用不同浓度(10 ng/μL、25 ng/μL或50 ng/μL)的AuNPs溶液处理不同发育阶段(第7 d、第8 d或第9 d)的鸡胚CAM血管,通过血管发育状态评价、RT-PCR和Western Blot检测血管发育相关因子VEGF和FGF的表达情况等,探究AuNPs对鸡胚CAM血管发育的影响。结果表明:(1)无壳培养体系中,9 d之前的鸡胚CAM血管不仅分支明显,血管分布密度适中,更加易于观察;(2)采用50 ng/μL AuNPs处理第7 d、第8 d和第9 d鸡胚CAM 4 d后的存活率极显著低于其余各组(P<0.01);(3)10 ng/μL AuNPs对7 d、第8 d和第9 d鸡胚CAM血管无明显影响,采用25 ng/μL和50 ng/μL AuNPs处理第8 d鸡胚CAM 48 h后,会引起血管分布变稀疏,血管颜色变浅。50 ng/μL AuNPs处理第8 d鸡胚CAM 3 d后,血管褪色明显,干瘪,鸡胚出现死亡;(4)25 ng/μL AuNPs处理第8 d和第9 d鸡胚CAM 48 h后的VEGF mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05)。50 ng/μL AuNPs处理第7 d鸡胚CAM后,相同时间段的VEGF mRNA表达量与对照组差异不显著(P>0.05)。25 ng/μL AuNPs处理第8 d鸡胚CAM 48 h后,FGF mRNA表达量极显著低于对照组(P<0.01);(5)10 ng/μL、25 ng/μL和50 ng/μL AuNPs处理第8 d鸡胚CAM 24 h后,VEGFR2和FGFR的蛋白表达水平与对照组无显著性差异(P>0.05)。25 ng/μL和50 ng/μL AuNPs处理鸡胚CAM血管48 h后可以降低VEGFR2蛋白表达水平,50 ng/μL AuNPs处理鸡胚CAM血管48 h后可以降低FGFR蛋白表达水平。25ng/μL Au NPs处理72 h后,可极显著下调鸡胚CAM中VEGFR2蛋白的表达(P<0.01),显著下调FGFR蛋白的表达(P<0.05),50 ng/μL AuNPs可极显著下调这两种蛋白的表达(P<0.01)。50 ng/μL AuNPs处理CAM血管时对鸡胚发育的毒性较大,鸡胚死亡率高。第8 d以后的鸡胚对AuNPs的反应更强烈。AuNPs处理鸡胚CAM需要48 h后才能出现抑制血管作用。宜采用25 ng/μL AuNPs处理第8 d无壳鸡胚48 h抑制CAM血管生长发育。结论:种蛋预孵48 h后转入鸭蛋壳内进行孵化,第8 d进行打孔通气,能够有效降低HIF-1α水平,缓解鸡胚缺氧,孵化率约47.67%±1.05%,获得形态发育、增重速度和繁殖性能与正常孵化鸡无差异的无壳培养鸡,从而建立了稳定高效的鸡胚无壳培养体系,并且该体系支持鸡胚心血管系统的正常发育,将无壳培养鸡胚的CAM作为血管模型,25 ng/μL AuNPs能够安全有效地抑制CAM血管的生成,下调鸡胚CAM血管网VEGF和FGF mRNA的表达,降低CAM的VEGFR2和FGFR蛋白表达水平,且可以保证鸡胚的正常发育,这为解析血管发生机制,研发抗血管治疗癌症等新策略奠定了基础。