【摘 要】
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目的:研究orexin-A对新生大鼠离体脊髓腹角神经元促离子型γ-氨基丁酸（GABA）受体功能的影响及其机制。方法:选取7-12天的新生SD大鼠,麻醉后,分离出含腰骶膨大的脊髓节段,制备切片。使用木瓜蛋白酶（Papain,0.18 g/30 ml人工脑脊液）消化切片并孵育40-60min。体视显微镜下,保留脊髓腹角,使用抛光的不同口径的巴斯德吸管急性机械分离单个细胞,待细胞贴壁后,应用膜片钳记录联
【基金项目】
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国家自然基金项目（31200828,31271155）； 安徽省高校自然科学研究项目（KJ2019A0411,KJ2018A0266）； 安徽省高校优秀青年人才支持计划项目（gxyqZD2016175,gxyq2017034）； 皖南医学院博士科研启动基金（rcqd201609）；
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目的:研究orexin-A对新生大鼠离体脊髓腹角神经元促离子型γ-氨基丁酸（GABA）受体功能的影响及其机制。方法:选取7-12天的新生SD大鼠,麻醉后,分离出含腰骶膨大的脊髓节段,制备切片。使用木瓜蛋白酶（Papain,0.18 g/30 ml人工脑脊液）消化切片并孵育40-60min。体视显微镜下,保留脊髓腹角,使用抛光的不同口径的巴斯德吸管急性机械分离单个细胞,待细胞贴壁后,应用膜片钳记录联合药理学方法对状态良好的神经元进行研究。在电流钳模式下,记录急性分离脊髓腹角神经元的自发动作电位（AP）;通过快速给药系统灌流给药,在电压钳记录模式下,首先应用GABA受体激动剂γ-氨基丁酸记录在脊髓腹角神经元诱发的电流,再给予orexin-A预处理2 min,观察对GABA电流的调制作用,基于此,给予OX1R选择性拮抗剂SB334867、OX2R选择性拮抗剂TCSOX229和PKC激动剂与阻断剂等药物分析orexin-A对GABA电流调制的作用机制。结果:（1）分离出脊髓腹角神经元形态良好,胞体形状多样,表面光洁,立体感较强且有较长的突起;（2）脊髓腹角神经元自发动作电位的基本电生理参数为:静息电位（-58.85±1.94）mV,阈电位为（-48.31±1.82）mV,锋电位幅度（61.75±2.11）mV,超射（12.96±3.32）mV,放电频率（10.50±2.69）Hz（n=4）;（3）记录到49例分离神经元,应用0.3 mmol/L GABA诱发的电流平均幅值为（734.57±423.76）p A,给予100 nmol/L orexin-A预处理2 min后,电流幅值可被显著压抑至（228.02±141.83）p A（P<0.001）,抑制率为（67.48±12.50）%;（4）在6例脊髓腹角神经元中,同时给予orexin-1型受体（OX1R）选择性拮抗剂SB334867（10μmol/L）和orexin-2型受体（OX2R）选择性拮抗剂TCSOX229（10μmol/L）可完全取消orexin-A对GABA电流的抑制作用（P>0.05）;（5）单独应用SB334867（n=8）或TCSOX229（n=8）均可部分解除orexin-A对GABA电流的压抑作用;（6）对5个神经元胞内给予10μmol/L Bis-IV（PKC抑制剂）后,orexin-A不再压抑GABA电流（P>0.05）;在6例神经元中,1μmol/L PMA（PKC激动剂）预处理2 min可模拟orexin-A的作用,显著抑制GABA电流,抑制率为（60.79±10.94）%,在此基础上,orexin-A则不能进一步压抑GABA电流（P>0.05）。然而,当胞内给予PKA抑制剂Rp-c AMP（50μmol/L）后,orexin-A仍可显著压抑GABA电流（n=5,P<0.01）,抑制率为（63.08±12.82）%;（7）当给予无Ca2+细胞外液（n=8）或胞内应用Ca2+螯合剂BAPTA（n=7）时,orexin-A对GABA电流的压抑作用不受影响,抑制率分别为（65.97±18.29）%、（67.29±11.35）%。结论:（1）本实验方法得到的脊髓腹角神经元表面光洁、胞体透亮,神经元状态良好,适合应用膜片钳记录技术对神经元受体和胞内信号转导机制的分析;（2）记录的脊髓腹角神经元自发动作电位连续且稳定,有超射说明细胞状态较好;（3）Orexin-A抑制脊髓腹角神经元的GABA电流,该效应可能经由OX1R和OX2R共同介导以及非Ca2+依赖的PKC信号通路的参与。
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