论文部分内容阅读
研究背景和目的毛囊是皮肤的附属器,是人体循环再生的微器官,因此毛囊的生物学研究具有十分重要的意义,而毛囊相关疾病是皮肤科临床上最常见的疾病之一,由于其直接影响患者外貌美观、病程长久、治疗手段不理想等原因,给患者带来了极大的精神压力,影响身心健康。毛发的生长得益于毛囊的正常增殖和分化,位于毛囊基底部的毛乳头细胞（Dermal Papilla Cells,DPCs）在毛囊的周期性调控中起主导作用,其功能异常可引起雄激素性脱发和斑秃等疾病。因此深入研究DPCs调控毛囊的生长机制对脱发性疾病有重大意义。DPCs是位于毛囊基底部的特殊间质成分,具有自分泌和旁分泌特征,在毛囊发育和周期性再生调控中起主导作用。在胚胎期,毛囊上皮细胞周期性增殖和分化这一再生过程中的诱导信号也来自DPCs。DPCs最显著的功能特征是诱导毛囊形成,其功能异常是导致毛囊周期性失衡和脱发的重要起始因素,因此,DPCs是毛囊研究的热点细胞之一。DPCs的凝集性生长是其重要的生物学特征,这种特性和毛乳头（Dermal Papilla,DP）的功能密切相关,但其凝集性生长和体外诱导毛囊重建的机制尚不明确,深入研究DPCs生物学功能变化的调控机制对毛囊生物学和毛发疾病的发病机制有重要意义。Wnt信号通路作为DPCs的重要信号途径,可在各个环节上与其他信号途径分子发生关联,对毛囊胚胎期形成、周期性再生、毛乳头生物学特性的诱导和维持具有关键作用。课题组前期的实验证实,Wnt信号通路关键信号分子TCF4（T Cell Factor 4,TCF4）基因在生长期毛囊及凝集性生长DPCs中呈上调表达。进一步在DPCs中过表达TCF4其培养液上清中HGF、IGF-1、SCF等蛋白分泌增加,表明TCF4可促进DPCs的增殖及外分泌功能,与DPCs的相关生物学状态密切相关。而Twist是位于常染色体上的编码碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）的转录因子,通过酵母双杂交发现可与TCF4结合的蛋白,在胚胎发育过程中起着重要作用。本课题拟研究在体外培养处于凝集性生长状态中的DPCs中是否存在Twist和TCF4的相互作用,以及其对TCF4调控的Wnt信号通路活性和其下游介导基因表达所存在的何种调控作用和对DPCs的生物学功能的影响。实验方法和结果1.人头皮毛囊中分离培养DPCs,观察原代、传代,冻存及复苏的DPCs生长状态及特性。2.利用免疫荧光共定位技术和免疫共沉淀技术检测在DPCs中Twist和TCF4存在相互作用。3.构建Twist敲低慢病毒pLKD-CMV-siRNATWIST、Twist过表达腺病毒pAdeno-MCMV-TWIST 和 TCF4 过表达腺病毒 pAdeno-MCMV-TCF4,转染至DPCs,利用倒置荧光显微镜明确其转染成功。4.设置实验分组:正常DPCs对照组（Control）、单独转染pAdeno-MCMV-TWIST（Twist）、pAdeno-MCMV-TCF4（TCF4）、pLKD-CMV-siRNATWIST（siTwist）转染组、pAdeno-MCMV-TCF4和pLKD-CMV-siRNATWIST（TCF4+siTwist）、pAdeno-MCMV-TWIST 和 pAdeno-MCMV-TCF4（Twist+TCF4）共转染组。使用CCK8检测细胞增殖活性影响,结果表明仅转染TCF4的DPCs的增殖率与空载体转染的空白对照相比,以时间为轴呈现显著增加（P<0.0001）。TCF4与siTwist表达载体共转染的DPCs比单独用TCF4转染的DPCs的增殖率显著降低（P<0.0001）,这表明敲低Twist对TCF4诱导的DPCs增殖具有抑制作用。相比之下,TCF4过表达载体和Twist过表达载体共转染的DPCs的增值率显著高于其他各组（P<0.0001）,这表明过表达Twist可以进一步增强TCF4诱导的DPCs增殖。5.通过实时荧光定量PCR、Western blot、ELISA技术发现,在Twist和TCF4过表达共转染的DPCs中,其表达的下游靶基因C-myc、Survivin和Cyclin-D1和外分泌的细胞因子IGF-1、VEGF和HGF的表达,相对于TCF4过表达组和空白对照组有明显的增加。结论1.免疫荧光共定位和免疫共沉淀证明Twist和TCF4在DPCs的细胞核中存在相互作用。2.过表达Twist可促进DPCs外分泌因子IGF-1、VEGF和HGF的合成,其中过表达Twist和过表达TCF4共转染可显著促进DPCs外分泌因子合成。3.过表达Twist可促进DPCs中Wnt信号通路下游靶基因C-myc、Survivin和Cyclin-D1表达,其中过表达Twist和过表达TCF4共转染可显著促进下游靶基因的表达。4.Twist与TCF4相互作用通过Wnt信号通路促进DPCs的增殖与外分泌。5.通过以上实验,为进一步了解DPCs生物学功能,特别是进一步探索了 DPCs中TCF4介导的Wnt信号通路的调控机制。