MITOFILIN的缺失抑制线粒体DN的转录而降低氧化磷酸化的功能

来源 :北京协和医学院中国医学科学院 北京协和医学院 中国医学科学院 清华大学医学部 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yuzhic
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线粒体氧化磷酸化系统是机体的能量工厂,它为机体的生命活动提供绝大部分的能量,该系统功能失常可导致多种疾病的发生,包括遗传性线粒体疾病、衰老及相关病变。在正常生理状态下,线粒体氧化磷酸化系统的产能迅速而灵敏的变化,以应答机体随时变化的能量需求。氧化磷酸化系统是由5个复合物组成,这些复合物的组成亚基由核DNA和线粒体DNA共同编码,其中,线粒体DNA编码的13个亚基是线粒体复合物所必需的,因此,线粒体DNA的转录调节对于氧化磷酸化适应机体的能量需求非常重要。   Mitofilin是一种线粒体内膜蛋白,为了深入研究该蛋白在氧化磷酸化中的作用,我们建立了Mitofilin敲除鼠。Southern blot和Western blot没有检测到Mitofilin-/-小鼠出生。统计学结果表明Mitofilin-/-小鼠胚胎在胚胎期死亡。采用胚胎形态学观察并结合RT-PCR和基因组PCR等方法,我们发现Mitofilin-/-胚胎死于胚胎期7.5天-10.5天之间;胚胎形态学观察显示Mitofilin-/-胚胎生长变缓,个体较杂合子和野生型小;TUNEL染色结果显示9.5天的Mitofilin/-胚胎中大量的胚体细胞死亡,9.5天后,Mitofilin-/-胚胎死亡并被逐步吸收;对8.5天的Mitofilin-/-胚胎利用电镜观察其超微结构,发现线粒体大小不一,内膜及嵴结构紊乱;在功能学检测方面,我们采用酶学染色实验方法对Mitofilin-/胚胎的氧化磷酸化功能进行检测,结果发现复合物Ⅳ活性较野生型和杂合子明显降低,而全部由核基因编码的亚基组装的复合物Ⅱ的活性没有明显改变。这些结果显示Mitofilin-/-胚胎中氧化磷酸化系统功能的缺失。对于Mitofilin+/-小鼠,我们通过复合物体内外酶学实验、ATP供给实验以及mtDNA转录本检测等实验发现:有mtDNA编码的亚基参与的复合物酶的活性明显下降,而全部由核基因编码的亚基组装的复合物Ⅱ的活性没有明显变化,说明Mitofilin+/-小鼠中Mitoifilin的部分缺失也会导致线粒体氧化磷酸化系统功能失常。基于Mitofilin-/4和Mitofilin+/-鼠中有mtDNA编码的亚基参与的复合物酶的活性明显下降,而全部由核基因编码的亚基组装的复合物Ⅱ的活性没有明显变化这一证据,我们推测Mitofilin可能是通过影响线粒体DNA的转录来调节氧化磷酸化系统。   为了进一步研究Mitofilin在线粒体DNA转录中的作用,我们首先通过线粒体DNA免疫共沉淀的方法明确了Mitofilin在D-loop区的结合位点,它在线粒体DNA的D-loop区的3端有强的结合位点,另外,Mitofilin也可以在线粒体DNA D-loop区的启动子区结合。通过蛋白质免疫共沉淀和GST-pulldown的实验方法,我们发现,Mitofilin可与线粒体转录因子TFAM、TFB1M和TFB2M相互作用。通过RNA干扰实验、线粒体DNA免疫共沉淀和Realtime PCR实验,我们发现Mitofilin的下调导致TFAM在线粒体DNA启动子区的结合减弱;同时使线粒体DNA的转录水平降低,而核基因编码的亚基的RNA水平并没有明显改变,但是核基因编码的亚基的蛋白含量降低,可能由于Mitofilin的干扰影响了线粒体的功能,导致这些核基因编码的亚基的蛋白不能正常发挥功能而被降解。基于上述这些实验证据,我们提出一种假设,即Mitofilin在线粒体DNA的D-loop区3端结合后,使得该区形成一loop结构,可使结合在启动子区的TFAM靠近并结合在线粒体DNA的启动子区启动线粒体DNA的转录。这种调节可能是线粒体氧化磷酸化系统适应机体能量需求的更为有效的调节方式。
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