研究背景急性脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)是临床中常见的一类运动系统创伤,可致不同程度的肢体四瘫或截瘫以及劳动能力的丧失,给社会和家庭带来沉重负担。研究表明,细胞凋亡是急性SCI后脊髓继发性损伤加剧的重要原因,减少细胞凋亡对于促进脊髓创伤后修复具有重要意义。MicroRNA(miRNA)是生物体内一类较短(约19～22个核苷酸)的非编码单链小分子RNA,通过与其靶mRNA的3’UTR区以完全互补或部分互补配对的方式相结合,诱导其降解或抑制其翻译的作用,从而发挥其调控基因表达的功能。近年来,有文献报道miR-21与中枢神经系统损伤有关。其中miR-21在许多细胞和动物模型中被证实具有强大的抗凋亡作用,但其在急性SCI中的作用尚未有文献报道。川芎嗪(Tetramethylpyrazine, TMP)是一种从中药川芎中提取的生物活性单体。近年来,本课题组研究表明TMP对急性SCI具有抗凋亡作用。但其抗凋亡机制尚有待进一步研究。为此,本研究以大鼠急性SCI模型为基础,探讨miR-21在急性SCI中是否具有抗凋亡作用及TMP在急性SCI的抗凋亡作用是否与调控miR-21及其凋亡相关靶基因的表达有关。为治疗急性SCI提供新的治疗靶点。第一章MicroRNA在大鼠急性脊髓损伤中的表达谱及其生物学分析目的探讨miRNA在大鼠SCI后的表达谱变化,分析其可能参与SCI继发性损伤的机制。方法(1)实验动物分组：成年雄性SD大鼠(180-220g)12只,随机分成4组(n=3)：SCI-ld组；SCI-3d组；Sham-1d组；Sham-3d组SCI-ld和SCI-3d组大鼠采用自制Allen’s打击法制作急性脊髓损伤模型；Sham-1d和sham-3d组仅行椎板切除术。(2)总RNA的提取：采用Trizol法提取脊髓组织总RNA。(3)微阵列芯片实验：利用miRCURYTM LNA Array (v.16.0)芯片检测4组中miRNA的表达谱。(4)芯片验证：运用qRT-PCR验证4个差异表达的miRNAs(miR-21、 miR-126、miR-24和let-7b)。(5)生物信息学分析：运用Mirbase、Miranda和Mirdb三个靶基因预测软件分析异常表达的miRNAs所调控的靶基因及运用KEGG数据库分析靶基因所涉及的信号通路。结果(1) microRNA芯片结果：共有22个miRNAs出现异常表达。其中1d组14个：9个miRNAs表达上调,5个miRNAs表达下调；3d组8个：3个miRNAs表达上调,5个miRNAs表达下调。(2)芯片验证：qRT-PCR结果示：miR-21在SCI后1天表达无显著变化,3天表达上调(P<0.01)；miR-126在SCI后1天表达无显著变化,3天表达下调(P<0.05)；miR-24在SCI后1天表达无显著变化,3天表达下调(P<0.01)；let-7b在SCI后1天表达下调,3天表达无显著变化(P<0.05)。(3)生物信息学分析：miR-21靶基因有22个,miR-24靶基因19个,miR-126靶基因17个,let-7b靶基因7个。pathway分析：这4个验证的miRNAs所调控的靶基因与以下通路有关：Valine, leucine and isoleucine degradation、Butanoate metabolism、Endocytosis、 Propanoate metabolism、Fatty acid metabolism、Tryptophan metabolism、 Lysine degradation、Wnt signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway和Chemokine signaling pathway。结论(1)大鼠急性脊髓损伤后miRNA的表达谱发生变化；(2)异常表达的miRNA所调控的靶基因与急性脊髓损伤的病理机制密切相关。第二章MicroRNA-21在大鼠急性脊髓损伤中的抗凋亡作用目的miR-21在许多细胞及动物模型中被证实具有抗凋亡作用,本实验探讨其在大鼠急性脊髓损伤中是否具有抗凋亡作用。方法成年雄性SD大鼠(108-220g)56只,以改良Allen’s打击法制作急性脊髓损伤(SCI)模型,随机分为Antagomir-21治疗组(n=28)和Negative control治疗组(n=28)。Antagomir-21组大鼠于术后至术后3天予以Antagomir-21治疗,通过胶囊渗透压泵予以鞘内给药(200nmol/ml, lμl/h)(1天组给药至处死前)；Negative control组大鼠予以等量Antagomir-21Negative control作相同干预,给药时间、剂量和速度同Antagomir-21组。每组(n=8)SCI大鼠分别用于检测FasL、 PDCD4和PTEN的表达水平(Western Blot, n=4每个时间点)；每组(n=8)SCI大鼠分别用于检测miR-21的表达量(qRT-PCR, n=4每个时间点)；每组(n=8)SCI大鼠分别用于组织化学方面的检测,如免疫组化、TUNEL和原位杂交；每组(n=4)SCI大鼠分别用于行为学评分(BBB评分)和损伤体积的评估,损伤后行为学评估至28天,随后处死用于损伤体积的评估。应用SPSS17.0软件包进行统计分析,组间比较采用T检验,P<0.05有统计学意义。结果(1)行为学评分：在SCI后,在两组中均可见大鼠后肢运动功能逐渐恢复。与Antagomir-21组大鼠比较,Negative control组大鼠恢复较快,在SCI14天后BBB评分显著增高(14天,P<0.05；21和28天,P<0.01)。(2)组织学评价：在SCI28天后,两组脊髓组织中均可见有空洞形成。Antagomir-21组的空洞体积较Negative control组大,残存正常脊髓组织较后者少。(3) Antagomir-21抑制效果评价：在SCI1和3天,Antagomir-21组大鼠脊髓组织中miR-21的阳性细胞数较Negative control组显著减少(P<0.05)；qRT-PCR结果示:Antagomir-21组大鼠脊髓组织中miR-21的表达量较Negative control组显著减少(P<0.01)。(4) Antagomir-21对细胞凋亡的影响：在SCI1天,Antagomir-21组大鼠脊髓组织中TUNEL阳性细胞数与Negative control组无显著变化；在SCI3天,Antagomir-21组大鼠脊髓组织中TUNEL阳性细胞数较Negative control组显著减少(P<0.05)。(5) Antagomir-21对FasL、PTEN与PDCD4表达的影响：1) FasL:Western blot结果示SCI1天,FasL蛋白两组表达无差异；SCI3天, Antagomir-21组中FasL蛋白的表达量较Negative control组显著增高(P<0.05)。2)免疫组化结果示PTEN主要在大鼠脊髓组织中的神经元细胞胞浆中表达,亦可见部分神经胶质细胞的胞浆中表达。SCI1天,两组中PTEN阳性细胞数无差异；SCI3天,Antagomir-21组中PTEN阳性细胞数较Negative control组显著增多(P<0.05)。Western blot结果示SCI1天,PTEN蛋白两组表达无差异；SCI3天,Antagomir-21组中PTEN蛋白的表达量较Negative control组显著增高(P<0.05)。3) PDCD4主要在大鼠脊髓组织中的神经元细胞胞浆中表达,亦可见部分神经胶质细胞的胞浆中表达。SCI1和3天,两组中PTEN阳性细胞数无差异。Western blot结果示SCI1和3天,PDCD4蛋白在两组中表达无差异。结论(1) miR-21在大鼠急性脊髓损伤中起抗凋亡的作用；(2) miR-21在大鼠急性脊髓损伤中起抗凋亡的机制,可能是通过调控促凋亡靶基因FasL和PTEN的表达其作用。第三章川芎嗪在大鼠急性脊髓损伤中对microRNA-21的调控作用目的在前期的研究中,己证明TMP在大鼠SCI中具有抗凋亡作用,但其抗凋亡机制仍不明确。本实验探讨TMP在大鼠SCI中能否通过调控miR-21及其凋亡靶基因的表达,影响凋亡细胞的表达。方法成年雄性SD大鼠(108-220g)52只,以改良Allen’s打击法制作急性脊髓损伤(SCI)模型,随机分为TMP治疗组(n=28)和Control治疗组(n=28)。TMP组大鼠于术后30min至术后3天予以TMP治疗,通过腹腔注射给药(200mg/kg,1次／天)(1天组给药至处死前)；Control组大鼠予以等量生理盐水作相同干预,给药时间、剂量和速度同TMP组。每组(n=6)SCI大鼠分别用于检测FasL、PDCD4和PTEN的表达水平(Western Blot, n=3每个时间点)；每组(n=8)SCI大鼠分别用于检测miR-21的表达量(qRT-PCR, n=4每个时间点)；每组(n=8)SCI大鼠分别用于组织化学方面的检测,如免疫组化、TUNEL和原位杂交；每组(n=4) SCI大鼠分别用于行为学评分(BBB评分)和损伤体积的评估,损伤后行为学评估至28天,遂后处死用于损伤体积的评估。应用SPSS17.0软件包进行统计分析,组间比较采用T检验,P<0.05有统计学意义。结果(1)行为学评分：在SCI后,在两组中均可见大鼠后肢运动功能逐渐恢复。与Control组大鼠比较,TMP组大鼠恢复较快,在SCI7天后BBB评分显著增高(7和14天,P<0.05；21和28天,P<0.01)。(2)组织学评价：在SCI28天后,两组脊髓组织中均可见有空洞形成。TMP组的空洞体积较Saline组小,残存正常脊髓组织较后者多。(3)TMP对miR-21表达的影响：在SCI1和3天,TMP组大鼠脊髓组织中miR-21的阳性细胞数较Control组显著增多(1天,P<0.05；3天,P<0.01)；qRT-PCR结果示：TMP组大鼠脊髓组织中miR-21的表达量较Control组显著减少(1天,P<0.05；3天,P<0.01)。(4)TMP对细胞凋亡的影响：在SCI1和3天,TMP组大鼠脊髓组织中TUNEL阳性细胞数较Control组显著增多(1天,P<0.05；3天,P<0.01)。(5)TMP对凋亡基因FasL、PTEN与PDCD4表达的影响：1) FasL:Western blot结果示SCI1天,FasL蛋白两组表达无差异；SCI3天,TMP组中FasL蛋白的表达量较Control组显著降低(P<0.01)。2)免疫组化结果示PTEN主要在大鼠脊髓组织中的神经元细胞胞浆中表达,亦可见部分神经胶质细胞、少突胶质细胞胞浆中表达。SCI1天,两组中PTEN阳性细胞数无差异；SCI3天,TMP组中PTEN阳性细胞数较Control组显著减少(P<0.01)。Western blot结果示SCI1天,PTEN蛋白两组表达无差异；SCI3天,TMP组中PTEN蛋白的表达量较Control组显著降低(P<0.05)。3) PDCD4主要在大鼠脊髓组织中的神经元细胞胞浆中表达,亦可见部分神经胶质细胞、少突胶质细胞胞浆中表达。SCI1天,两组中PTEN阳性细胞数无差异；SCI3天,TMP组中PDCD4阳性细胞数较Control组显著减少(P<0.01)。Western blot结果示SCI1天,PDCD4蛋白两组表达无差异；SCI3天,TMP组中PDCD4蛋白的表达量较Control组显著降低(P<0.05)。结论(1)TMP在大鼠急性脊髓损伤中具有抑制细胞凋亡,减轻脊髓组织损伤,促进运动功能的恢复的作用。(2)TMP在大鼠急性脊髓损伤中的抗凋亡作用可能与调控miR-21及其促凋亡靶基因的表达有关。