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本课题在明确明确Heyl基因在BMP9介导的多潜能干细胞成骨分化过程中的表达及其功能的基础上(第一部分),研究Notch信号通路在BMP9诱导的多潜能干细胞成骨分化中作用和机制(第二部分)。
第一部分、heyl基因在骨形态发生蛋白9介导的多潜能干细胞成骨分化过程中表达及其功能研究
目的:明确BMP9介导的MSCs成骨分化中heyl的表达情况,并探讨heyl对BMP9介导的MSCs成骨分化作用。
方法:利用腺病毒表达载体(AdBMP9/AdGFP、AdHeyl/AdRFP)处理C2C12,用细胞化学染色和活性定量测定早期成骨标志物ALP,建立定量RT-PCR检测方法测定Notch信号通路靶基因heyl;
结果:AdBMP9作用下,1、3、5、7 d ALP活性持续增加(P＜0.05),ALP的含量与AdBMP9具有剂量依赖性;heyl一过性升高,其与AdBMP9亦呈剂量依赖性,同时发现heyl可协助AdBMP9上调ALP的含量(P＜0.05),但不能单独起效。
结论:AdBMP9具有较强的诱导多潜能干细胞成骨分化作用,早期成骨作用随着时间延长而逐渐增强,并与AdBMP9的量存在量效关系,heyl表现出一过性升高,过表达heyl可以协助BMP9的诱导成骨作用,这与heyl的量亦呈正相关,但是heyl本身却不能促进成骨分化。
第二部分、Notch信号通路在骨形态发生蛋白9诱导的多潜能干细胞成骨分化中的作用机制初步研究
目的:探讨Notch信号通路在BMP9介导的MSCs成骨分化中的作用。
方法:用细胞密度试验(间接)和Notch信号通路抑制剂(DAPT)处理C2C12(直接)了解Notch信号通路在BMP9介导的MSCs成骨分化中的作用;用细胞化学染色和活性定量测定早期成骨标志物ALP;定量RT-PCR检测方法测定heyl及Notch信号通路配体、受体表达变化。
结果:AdBMP9处理的C2C12细胞Notch信号通路配、受体有不同程度的上调,其中受体Notch4和配体Jag-1上调最为明显(分别为11.3和5.1倍);高细胞密度组(细胞紧密生长)比低细胞密度组(细胞尚未完全接触)受体表达显著升高,配体Jag-2、D11-1表达亦升高,配体D11-3表达下调明显;80％和40%细胞密度组ALP量和heyl表达均高于20%组(P＜0.05);DAPT抑制剂组中ALP活性明显降低(P＜0.05)并且heyl表达下调。
结论:Notch信号通路激活时BMP9的促成骨作用加强,heyl的表达升高是其加强的原因;在Notch信号通路被阻断时,BMP9的促成骨作用减弱,heyl的表达下降是其减弱的原因。