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本研究用含有谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)蛋白基因的pGEX—4T—1质粒转化E.coli BL21,经IPTG诱导后,得到GST蛋白,并进行纯化,用纯化的GST蛋白作为抗原免疫Balb/C小鼠,利用间接酶联免疫吸附法(ELISA)对免疫小鼠产生的抗体进行检测。 应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,建立分泌抗GST的单克隆抗体杂交瘤细胞株。通过对杂交瘤细胞上清的检测、鉴定,筛选出4株高亲和力的杂交瘤细胞株1C1、3H11、4F5、4H11。将获得的融合细胞注入小鼠腹腔制备腹水。其腹水最高间接ELISA效价达1:819200,亚型分别为IgG1和IgG2a,抗体分子量为150KD。Western-Blot分析表明,该单抗能够与GST蛋白及含有GST的融合蛋白发生特异性的结合。 将构建好的含GST—HA1基因的重组质粒,经1mmol/LIPTG诱导,在大肠杆菌BL21中表达。表达的融合蛋白GST—HA1的分子量为62KD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,融合蛋白能够与H5亚型禽流感阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原性。 利用GST单抗和GST—HA1融合蛋白建立诊断H5亚型禽流感病毒抗体的双夹心ELISA方法。通过方阵滴定法确定抗原和抗体的最佳工作浓度,GST—HA1蛋白为1:5000倍稀释,单抗为1:160倍稀释。该方法与传染性法氏囊阳性血清、传染性支气管炎阳性血清、鼻炎阳性血清、大肠杆菌阳性血清、新城疫阳性血清、H9亚型AIV阳性血清、鸡贫血阳性血清均无交叉反应。批内变异系数为3%～4%。结果表明,该检测方法特异、灵敏、可靠,与血凝抑制实验符合率高,为95%(20/21)。该方法不需要特殊设备和技术,便于推广。 建立的双夹心ELISA方法用GST—HAl融合蛋白代替了禽流感全病毒,因此安全性更好,为相关试剂盒的研制奠定了基础。