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由于罗非鱼生长速度快、肉质鲜美、价格低廉，因此一直深受广大养殖户和消费者的喜爱。但因为罗非鱼是一种极不耐寒的热带鱼，所以其养殖区域只能限制在南方地区；即使在南方地区，如果遇上2008年时的冻灾也会时罗非鱼大面积死亡，造成养殖户的巨大损失。如果能够通过转基因技术获得一种具有稳定抗冻性能的罗非鱼，对扩大罗非鱼养殖范围以及在冻灾中减少经济损失均有巨大的意义。奥里亚罗非鱼为罗非鱼属丽鱼科，由于雄性奥里亚罗非鱼与雌尼罗杂交后得到的奥尼罗非鱼与父本、母本相比，具有生长速度快、产量高等特点。因此，本研究选取奥里亚罗非鱼为研究对象。该项目通过多位点基因打靶技术结合锌指核酸酶技术建立高效基因打靶技术，本论文主要构建罗非鱼抗冻基因打靶载体和锌指核酸酶真核表达载体，为建立罗非鱼高效多位点基因打靶技术获得关键材料。
首先，克隆罗非鱼rRNA基因。动物rRNA基因是一种GC含量高、结构复杂的重复序列。该研究经反复摸索后选用LAPCR法，即LA PCR Taq酶结合GC缓冲液来扩增罗非鱼复杂的rRNA基凶重复序列，经测序鉴定最终克隆了4个奥里亚罗非鱼rRNA基因片段。结果表明：4个奥里亚罗非鱼rRNA基因片段全长分别为451 bp、2，286bp，3，064 bp、1，977 bp。采用DNAstar的SeqMan软件将4个罗非鱼rRNA基因片段序列拼接成6，949bp的片段，找出18S rDNA、ITS1、5.8SrDNA、ITS2和28SrDNA大小分别为1，841 bp、539 bp、156 bp、495bp和3，917 bp。已将全序列提交NCBI的GenBank，接受登记编号为GU289229。并探索了克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用、循环参数的调整等措施。
接着，构建罗非鱼抗冻基因打靶载体。以奥里亚罗非鱼的重复rRNA基因间的间隔序列为靶位点，基于多克隆载体pYLVS构建多位点基因打靶载体，为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料。首先构建pYLVS-DS2质粒和pOP5a-AFP质粒，然后构建pYLVS-DSl-DS2罗非鱼通用打靶载体，最后构建成了罗非鱼抗冻基因多位点打靶载体pYLVS-DSl-OP-AFP-DS2。
然后，构建锌指核酸酶表达载体。本课题将锌指核酸酶的应用与多位点打靶相结合，理论上可将打靶效率提高到18％以上。经过筛选将罗非鱼基因组上的中度重复序列rDNA的18S和5.8S之间的间隔序列ITSl作为靶位点，设计针对靶标的两对三联体锌指蛋白ZFPBL、ZFPBR；ZFPSR、ZFPSL，将以上两对锌指蛋白分别连在pMD-18Tsimple载体上，获得pMD-18T simple-ZFPBL、pMD- 18T simple-ZFPBR；pMD-18Tsimple-ZFPSL、pMD-18T simple-ZFPSR。接着，将所得两对锌指核酸蛋白分别插入到真核表达核载体pCDNA-NLS-FOK1中，构建了两对真核表达载体pCDNA-NLS-ZFNBR、pCDNA-NL.S-ZFNBL;pCDNA-NLS-ZFNSR、pCDNA-NLS-ZFNSL,
锌指核酸酶诱导的多位点基因打靶技术将很大程度解决目前存在的打靶效率低、安全性等问题。