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该论文利用RT-PCR和RACE技术克隆了OPG和BmK ITa1两个基因,并分别对其进行了表达及功能研究.第一部分,OPG及其突变体OPG-280、OPG-Fc的构建、表达及功能研究.破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF或称osteoprotegerin,OPG)是1997年发现的具有降血钙作用和防止骨质流失的一种新的可以调节骨密度的糖蛋白质.成熟的OPG共有380个氨基酸,存在着单体和二聚体两种形式,其中Cys<379>对OPG形成同源二聚体是必需的.之前,我们利用RT-PCR技术首次从中国人正常肝细胞株L02中克隆到一种新的破骨细胞形成抑制因子变体基因(OPG-372)(GenBank登录号AF134187).为了构建OPG一系列突变体,进一步比较重组OPG单体与同源二聚体的体内代谢及其生物效应稳定性,我们接着从中国人外周血淋巴细胞(PBL)中克隆了OPG基因3端基因组序列210bp,与国外文献报道的OPG cDNA3序列相一致,将此210bp与OPG-372重组拼接得到全长无缺失的OPG.同时,考虑到人免疫球蛋白IgG Fc片段的多个二硫键可能有助于OPG形成同源二聚体,我们在OPG-372 C端融合Fc得到加长突变体OPG-Fc.另外,为了调查重组OPG最小的功能片段,结合其结构特点,我们去除OPG-372 C端的100个氨基酸,得到缩短突变体OPG-280.之后,该论文首次成功地将OPG及其变体OPG-280和OPG-Fc基因克隆于表达载体pET-28a中,在大肠杆菌中进行融合表达.进而,将OPG、OPG-280和OPG-Fc基因分别插入昆虫杆状病毒供体质粒pFastBac1和pFastBacHTb中,成功地将OPG、OPG-280、OPG-Fc三种基因在粉纹夜蛾Tn-5B1-4细胞中得到高效表达,而且OPG-Fc在Tn细胞中形成同源二聚体.同时,我们首次将OPG、OPG-280和OPG-Fc基因克隆于昆虫病毒转移载体pBacPAK8中,并将它们在家蚕核型多角体病毒(BmNPV)-家蚕(Bombyx mori)表达系统中进行了高效表达,通过非还原SDS-PAGE发现OPG和OPG-Fc均能形成同源二聚体,而且表达的OPG蛋白出现糖基化.在以上三个表达系统中,C端缺失100个氨基酸的OPG-280仅以单体方式存在,OPG仅在昆虫虫体中可以形成二聚体,C端融合人免疫球蛋白Fc片段的OPG-Fc在大肠杆菌中没有形成同源二聚体,而在Tn细胞和家蚕虫体内均存在单体和同源二聚体两种形式,推测Fc自身的多个二硫键有助于OPG同源二聚体的形成.第二部分,蝎毒素基因BmK ITa1的克隆、表达及其重组蛋白酰胺化后加工的研究.接着,我们将BmK ITa1基因克隆至装有融合蛋白DsbC的表达载体pET-40b中,得到融合基因DsbC-BmK ITa1在大肠杆菌中重组表达.由于BmK ITa1基因的C末端的GKK三个残基可能会在毒素成熟过程由于C末端酰胺化中被加工去除.而体内酰胺化反应是由甘氨肽酰化单氧酶(peptideglycine α-amidating monooxygenase,PAM)催化完成的.另外,考虑到家蚕体内可以产生类似羧基末端α-酰胺化作用的羧末端酰胺化肽,可能有助于完成外源重组蛋白的酰胺化后加工.我们首次将BmK ITa1和DsbC-BmK ITa1基因在家蚕虫体中进行表达.