目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD),在近年来,呈不断增加的趋势,严重时甚至可以导致死亡。由于AD的病因及机制错综复杂,涉及到多系统,只有对其进行多方面的干预措施,才有可能提高防治水平。当归芍药散为多年来报道较多,且作为治疗AD有效的中医经典复方。为此,对其入血成分进一步研究,探讨具体哪些成分有效以及如何作用于靶点。同时,由于线粒体对AD的发病有至关重要的作用,为探讨当归芍药散及有效成分是否能稳定线粒体功能,降低A β对线粒体损伤,从这个角度进行深入研究当归芍药散入血成分治疗AD的作用机制。方法:8月龄雄性SPF级APP/PS1小鼠和野生型小鼠共85只,35～50g,各自分别随机分为正常组15只,溶媒对照组(0.9%NaCl)10只、各用药组(藁本内酯组、阿魏酸组、芍药内酯苷、川芎嗪、芍药苷)各10只,其中藁本内酯有两个剂量组,灌胃给药,一天一次,共12周。1.当归芍药散入血成分对APP/PS1小鼠行为学的影响(1)行为学实验预筛选在小鼠灌胃前一周,水迷宫不设置任何站台,将小鼠放入其中,水迷宫的背景与小鼠的颜色一样,主要是为了避免干扰,小鼠游泳lmin后,观察其游泳姿态,记录每只小鼠的平均游泳速度,经过对结果的分析,将游泳姿态正常和平均游泳速度类似的小鼠分为一组,然后进行后面的行为学测试,在实验过程中如若发现小鼠异常,如抽搐等情况,及时停止测试。(2)Morris水迷宫测试①迷宫适应训练:小鼠灌胃12周后开始进行适应训练,第1天,各小鼠训练2次,由相对应的入水点面向池壁放入水中,编为1、2、3、4号入水口,记录时间为1 min。若小鼠在规定的时间即1 min内,顺利找到平台,记录下来,此称为逃避潜伏期,接着强迫小鼠停留20 s后再放回饲养笼;若在规定时间(1min)内没有找到平台,记录小鼠的逃避潜伏期,如上所知即1min,然后将其引至平台,强迫停留20s后放回饲养笼。②定位航行试验:此阶段为期5天,第4象限中心一般是放置平台的位置,每只小鼠1天训练4次,每次1个象限,入水口用阿拉伯数字表示,如1、2号,平台在第四象限。若小鼠在规定的时间即1 min内,顺利找到平台,记录下来,此称为逃避潜伏期,停留10 s后再放回饲养笼;若在规定时间(1min)内没有找到平台,记录为1min,将其引至平台,强迫停留10s后放回饲养笼。各小鼠一天接受4次训练。③空间探索试验:在第二阶段试验结束后的次日,即第七天,此时平台去除,在第四平台象限的对应侧,即第2象限放入小鼠,记录60s内的运动轨迹,计量在第四象限的停留时间、运动轨迹。同时记录穿越原平台的次数。(3)Y迷宫①训练阶段:将三个臂分别设置为ABC,假定A臂为起始臂,B为新异臂,将抓住小鼠尾部,面朝壁面由A臂放入,B臂被与同色挡板盖住,观察小鼠在A和C臂中活动的时间,一般持续10min,给小鼠进行一个基本的记忆。隔1h后再进行下一个检测期。②检测阶段:把新异臂隔板去除,同样将小鼠由起始臂放入,观察其在3个臂中自由活动的情况,持续时间为5min。设置秒表,采用手动记录每只小鼠在5min内穿过各个不同的臂的次数与异常,对于特殊情况的小鼠做好标记,以便后期方便分析。在Y迷宫实验中,主要统计5min内小鼠在ABC三个臂中的穿梭次数。(4)旷场试验①在无干扰、无噪音的环境下进行实验。将动物面朝壁面放入底面中心,预先设置好摄像机与计时器。观察小鼠在30min内的活动情况。提前准备好酒精与抹布,用酒精清洗方箱内壁及底面,主要目的是为了避免上只动物残留的气味、大小便等,以便下次结果测试更精确,然后再用抹布擦干后进行实验。②主要观察指标:主要观察小鼠在中心区域活动的时间,参考以25宫格为准的中心区域。2.当归芍药散入血成分对APP/PS1小鼠线粒体功能的影响取材,2.5%戊二醛固定后,更换PBS,4度保存,送电镜室继续后续步骤;先用PBS漂洗5×15min;再用1%锇酸进行1-2h的固定;接着PBS漂洗3次,各持续15min;脱水的步骤依次为50%、70%、90%、丙酮各一次,每次持续20min;再用100%丙酮进行3次脱水,每次20min;浸透可以选择纯丙酮+树脂(2:1)在室温下3-4h或者纯用丙酮+树脂(1:2)在室温下3-4h,也可采用过夜或纯树脂过夜;在60℃高温,持续24h进行切片的包埋与聚合;然后将它们切成50-70 nm的薄片;之后用醋酸双氧铀-枸橼酸铅进行双染色;最后透射电镜观察。结果:1.当归芍药散入血成分对APP/PS1小鼠行为学的影响本研究选择的是,APP/PS1双转基因小鼠,将其随机分组为对照组、模型组以及各给药组,每天给药1次,持续给药12周后开始进行行为学实验。本行为学实验结果显示,在Y迷宫测试中,与对照组相比,模型组自发交替实验的百分比明显较短(P<0.001),差异有统计学意义;与模型组相比,芍药苷组(P<0.001)、芍药内酯苷组(P<0.01)、阿魏酸组(P<0.001)、川芎嗪组(P<0.05)、藁本内酯低剂量组(P<0.001)、藁本内酯高剂量组(P<0.001)差异有统计学意义(表2、图1)。在水迷宫实验中,对照组、模型组在定位航行中的登台潜伏期延长,模型组逃避潜伏期明显延长(P<0.05)(表3、图2);在空间探索实验中,模型组60s内穿环次数明显减少(P<0.01)(表4、图3)。在Morris水迷宫实验中,DSS入血成分与模型组对比,芍药内酯苷组、阿魏酸组、藁本内酯高低剂量组逃避潜伏期均明显缩短(P<0.05),芍药苷组、川芎嗪组逃避潜伏期无明显差异;藁本内酯高低剂量探索游过原站台位置均明显增加(P<0.05),芍药苷组、芍药内酯苷组、阿魏酸组、川芎嗪组无明显差异。在旷场实验中,与对照组相比,模型组差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,芍药苷组、藁本内酯低剂量组(10mg/kg)进入中心区域的时间明显减少(P<0.05),差异有统计学意义,其余用药组无统计学意义(表5、图4)。结果综合表明,当归芍药散入血成分中的藁本内酯高低剂量组、芍药内酯苷组、阿魏酸组可以改善APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆功能障碍,其中藁本内酯低剂量组要强于藁本内酯高剂量组、芍药内酯苷组、阿魏酸组,从而说明藁本内酯AD模型动物的学习记忆有较明显的改善。2.当归芍药散入血成分对APP/PS1小鼠线粒体功能的影响根据电镜结果,当归芍药散入血成分中藁本内酯高、低剂量组,芍药内酯苷组对AD动物模型APP/PS1双转基因小鼠的左海马CA1区的线粒体损伤均有一定的改善作用,其中藁本内酯低剂量组(10mg/kg)尤为明显,藁本内酯高剂量组(40mg/kg)与芍药内酯苷组作用较弱。结论:1.当归芍药散入血成分藁本内酯、芍药内酯苷、阿魏酸组对AD动物模型APP/PS1小鼠在学习记忆能力上具有改善作用。2.当归芍药散入血成分藁本内酯、芍药内酯苷对AD动物模型APP/PS1小鼠脑内海马CA1区线粒体损伤有一定的改善作用,保护A β造成的线粒体损伤,据此推断对阿尔茨海默病的神经保护作用,其机制可能是通过改善Aβ造成的线粒体损伤从而起到神经保护作用。总而言之,根据本实验结果表明,当归芍药散入血成分藁本内酯、芍药内酯苷对AD动物模型的学习记忆功能障碍有较好的改善作用,它们可能对线粒体保护、稳定线粒体功能有一定的作用,为未来开发治疗AD的新药提供新的靶点。