视网膜色素变性是一种以视杆和视锥光感受器细胞丧失为特征的遗传性视网膜疾病,是进行性视力丧失和遗传性失明的主要原因。光感受器细胞是视网膜内的感觉神经元,它们将光信号转换为电信号传递到下游,再到高级中枢,以进行视觉信号处理。患有视网膜色素变性的患者最初由于失去视杆细胞产生夜盲的表型,其次是由于继发的视锥细胞变性而导致的白天视力丧失。PDE6B基因编码鸟嘌呤3’,5’-磷酸二酯酶6 β亚基,参与到视杆细胞光信号转导过程中,约占常染色体隐性遗传视网膜色素变性病因的4%至5%。无视杆小鼠(rd1小鼠)是视网膜色素变性小鼠模型,在Pde6b基因中发生一个单碱基的点突变(Y347X,从C到A)。突变小鼠表现出早发的严重的视杆细胞变性,导致进行性视力丧失并最终完全失明。因此,rd1小鼠是用于推进视网膜色素变性疾病治疗方法研究的合适的动物模型。之前,已有研究工作开发了多种策略来拯救rd1小鼠中的光感受器细胞变性,例如补充缺失基因的腺相关病毒(AAV)载体或促进细胞存活的小分子药物,以及小鼠受精卵基因编辑,但是这些方法都显示出明显的缺点,例如效率低或无法进行基因校正以维持持久的表型等,而大多数人类遗传疾病是在出生后诊断出来的,受精卵操作手段对此并无助益。因此,需要建立具有更高在体基因编辑效率的基因编辑新策略,以在出生后动物模型中进行精确的基因编辑。簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)-Cas9是一种已广泛用于基因工程中的基因编辑技术。CRISPR-Cas9技术依靠单向导RNA指导Cas9在目标基因位点上产生DNA双链断裂,断裂可以通过非同源末端连接(NHEJ)修补或依赖DNA模板进行同源性定向修复(HDR)途径,其中NHEJ已被广泛用于基因敲除。但是,NHEJ是易于出错的基因组编辑途径,可在DSB中引入其他插入或缺失。相反,尽管被认为效率低下并且依赖于细胞分裂,HDR依然是广泛应用于种系或可增殖细胞的基因组编辑的高保真途径。然而,哺乳动物成熟组织中的大多数细胞,包括神经元,随着成熟而丧失其增殖能力。因此,Cas9介导的HDR途径很少在成熟组织和细胞中应用。因此,我们旨在设计一种基于HDR的基因组编辑技术,以精确纠正视网膜色素变性治疗出生后的rd1小鼠视网膜中的基因突变。大肠杆菌重组酶A(RecA)蛋白可以提高哺乳动物和植物细胞中的同源重组效率。RecA是5’-三磷酸腺苷(ATP)依赖性的DNA结合蛋白,可在同源重组中催化DNA链交换反应。这些事实促使我们研究在Cas9介导的基因组编辑中添加细菌RecA蛋白是否可以特异性增加HDR的频率,因此我们开发了一种Cas9/RecA技术,该技术融合了化脓性链球菌Cas9(spCas9)和靶向sgRNA的RecA,以纠正出生后rd1小鼠体内的基因突变,从而提高了体内HDR效率。我们的研究表明,在体外和体内,使用Cas9/RecA系统均可提高HDR效率。且该系统在有丝分裂和退出有丝分裂的感光细胞中,都可以大幅度提高HDR效率,从而修复错误基因、提升感光细胞存活。更重要的是,视觉行为学范式瞳孔光反射和离体视网膜电图ERG显示,修复后小鼠视网膜显示出明显的ERG信号和瞳孔光反射提升,表明rd1小鼠视觉能力得以一定程度的修复。综上,本研究建立了一种改进的基于HDR的基因修复系统,实现了退出有丝分裂神经元的在体精准基因修复,一定程度上表明了从源头治疗此种单基因突变导致的眼盲疾病的理论可行性,具有重要的科学和临床意义。