硫是植物生长所必需的大量元素之一。植物通过根系吸收土壤中的硫酸盐,在胞内首先经ATP硫酸化酶活化为腺苷5’-磷酰硫酸(adenosine 5’-phosphosulf ate, APS).APS的进一步代谢包括初级代谢和次级代谢,分别是APS还原酶催化APS生成亚硫酸盐,腺苷5’-磷酰硫酸激酶(adenosine 5’-phosphosulfate ki nase, APSK)催化APS磷酸化生成3’-磷酸腺苷5’-磷酰硫酸(3’-phosphoadenos ine 5’-phosphosulfate, PAPS), PAPS进一步作为硫酸根的供体参与胞内的硫酸化反应,生成副产物3’,5’二磷酸腺苷酸(3’,5’-biphosphate adenosine, PAP)。近年来的研究表明,拟南芥APSK在调节硫的初级和次级代谢的过程中具有重要功能,且受氧化胁迫的APSK1在C86和C119之间形成二硫键降低其催化活性。水稻的同工酶是否也会受到氧化还原调控尚无相关报道。通过对APSK序列进行分析,发现水稻APSK1含有与拟南芥APSK C86和C119同源的半胱氨酸。本研究对水稻APSK1进行了基因克隆、突变和酶活分析。利用RT-PCR,获得了APSK1基因。通过经原核表达、纯化获得APSK1及其双突变蛋白C36A/C69A。体外酶活分析表明,在氧化环境中APSK1活性受到抑制,而C36A/C69A双突变蛋白不受氧化环境的影响。结合模拟的三维结构,我们推测水稻APSK第36位与第69位半胱氨酸之间可形成二硫键,而水稻受到氧化胁迫时可降低APSK活性,促进硫合成GSH提高水稻的抗氧化能力。3’,5’二磷酸核苷酸酶(3’,5’-bisphosphate nucleotidase)催化PAP和PAPS的3’磷酸水解生成AMP和APS,是胞内硫代谢的重要调控者之一。研究发现,高表达3’,5’二磷酸核苷酸酶可提高植物抗盐性。酵母3’,5’二核苷酸酶亦称为HAL2,参与细胞硫代谢和抗盐过程。HAL2活性的改变可调节胞内PAP浓度,从而影响磺基转移酶,酰基载体蛋白合酶和RNA加工酶的活性[1],进而影响细胞的生长发育。本实验室的前期工作表明,HAL2突变蛋白G236V对PAP有较高的催化效率(1.5×107M-1·s-1),而对PAPS有极低的催化效率(2.6×103M-1·s-1)。本文通过在大肠杆菌细胞中过量表达G236V分析其对细胞的影响,与预期结果相反,我们发现在无还原性硫存在的培养基中,G236V较HAL2的表达极大降低了细胞的生长速度。HAL2和G236V可水解1,6二磷酸果糖(fructose 1,6-bisphosphate,FBP),是PAP水解的竞争性抑制剂。活性分析发现G236V在高浓度FBP的情况下,较HAL2具有更高的水解FBP活性。我们推测G236V对胞内FBP的大量水解是降低细胞生长的主要原因。丙酮酸钠作为碳源的实验表明,其不能恢复G236V过表达引起的细胞生长速率降低,我们推测丙酮酸钠不是大肠杆菌的优质碳源是导致此结果的原因。所以我们认为G236V通过降解1,6二磷酸果糖,影响了细胞的能量代谢,从而降低了细胞的繁殖速度。为进一步验证此假设,我们构建了大肠杆菌HAL2同源蛋白CysQ (V152,功能与G236V相当)及其突变体V152G(功能与HAL2相当)的表达载体。与上述结果相反,V152G在大肠杆菌中的过量表达降低了细胞的生长速度。进一步分析,我们发现FBP对CysQ与V152G水解PAPS抑制能力相当,他们水解FBP的能力也相当；而V152G (Km= 24.18 μM)较CysQ (Km= 35.31 μM)对PAPS具有更强的亲和力,所以V152G的过表达将有效降低PAPS含量及硫的还、原速度,从而可能降低细胞生长繁殖。综上所述,本论文克隆分析了氧化还原条件对水稻APSK的功能调控,以及3’,5’二磷酸核苷酸酶的点突变对其活性及生理功能的影响。结果发现氧化条件,可促进水稻APSK分子间二硫键的形成,降低其磷酸化APS的能力；HAL2较其突变体G236V具有较低的水解FBP水解能力,较高的PAPS水解能力；CysQ较其突变体V152G具有相当的FBP水解能力,较低的PAPS水解能力。