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嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus,A.caldus)属于嗜酸性硫杆菌属,是化能自养的革兰氏阴性菌,一般生长在极端的酸性环境中(pH值1-3),通过氧化硫和其他的还原性硫化合物获得能量,用于固定二氧化碳进行自养生长。由于A.caldus产生硫酸和缓解硫化矿物钝化的重要特性,目前在在生物冶金领域得到了广泛的关注。生物冶金过程中,由于金属矿物的溶解会使冶金微生物面临严峻的渗透压胁迫环境,所以研究A.caldus的渗透压调控机制具有重要的意义。渗透压是微生物生长过程中会遇到的环境影响因素之一,高渗透压胁迫通常会对细菌造成细胞膜结构变化、细胞周期停滞、DNA损伤、转录翻译抑制等影响。因此细菌需要特定的渗透压调控机制,减少渗透压胁迫对自身的不利影响。EnvZ/OmpR双组分调控系统是许多细菌体内应对渗透压胁迫的重要调控机制,但在自养菌中研究较少,从该双组分系统的调控功能展开探究,揭示嗜酸性喜温硫杆菌的渗透压调控机制对认识该类微生物的极端环境适应性具有重要意义。本文对A.caldus中EnvZ/OmpR双组分调控系统的研究,主要包括以下几个方面:一、通过序列相似度比对、进化树分析和蛋白二级结构分析等生物信息学方法,发现EnvZ/OmpR双组分在不同细菌中序列结构相对保守,与同属的嗜酸性氧化亚铁硫杆菌亲缘关系最近,其次是沙门氏菌、大肠杆菌等。以大肠杆菌、沙门氏菌中转录因子OmpR结合基序作为参考扫描A.caldus基因组,共得到分值大于7的阳性结果584个,结合ompR敲除株转录组测序信息,筛选可能结合基序50个。二、利用实验室的基因无痕敲除策略,对组氨酸激酶envZ基因orf2589进行了无痕敲除,得到了敲除菌株ΔenvZ。在ΔenvZ和本实验室的ΔompR敲除株基础上构建了回补菌株 ΔenvZ(pJRD215-PtetH-envZ)和 ΔowmpR(pJRD215-PtetH-ompR),过表达菌株 A.coldus MTH-04(pJRD215-PtetH-envZ)和 A.caldus MTH-04(pJRD215-PtetH-ompR)。系列菌株的成功构建为后续研究奠定基础。三、在不同渗透压条件下,分析envZ敲除株与ompR敲除株、野生型的生长表型差异。从生长曲线可以看出,当渗透压胁迫较小或者不存在时,只有ompR的敲除会对生长产生影响,当存在高渗胁迫时,envZ或ompR的敲除均会对生长和渗透压调控能力产生影响,二者的区别是envZ的敲除在连四硫酸盐能源下作用突出,而ompR的敲除在硫粉能源下作用明显。四、利用荧光定量PCR技术探究EnvZ/OmpR双组分系统调控机制。对生物信息学预测调控基因进行了转录分析,确定了 EnvZ/OmpR的调控基因,发现其主要从物质能量代谢、转运系统。限制修复系统、核酸修饰代谢等方面发挥调控作用。