研究背景周围神经损伤是整复外科常见的疾病之一,主要来源于物理创伤、肿瘤、代谢性疾病等,每年全球有超过五十万患者忍受着周围神经损伤所带来的功能障碍。周围神经相比于中枢神经系统,有更强组织再生能力,然而其功能恢复率仍不尽人意。在临床上,经过手术修复的周围神经缺损,功能恢复率低于40-50%[1,2]。部分神经断伤中,神经可通过手术无张力直接缝合,然而更多的神经断伤中出现神经组织缺损,损伤两段无法直接缝合,需通过移植物桥接修复。目前自体神经移植（ANG）作为手术治疗周围神经缺损的金标准,但由于移植物来源有限、供区功能受损、移植后神经瘤及瘢痕形成等,均影响其临床应用[3]。寻找ANG的替代方法,提高功能恢复效率,成为整复外科及组织工程领域的热点及难点问题。构建组织工程神经桥接修复周围神经缺损,是目前的主要方向之一。组织工程神经主要由神经导管和种子细胞及其他添加因子构成,神经导管的来源包括自体组织和人工材料[4]。本课题组携带少量肌纤维的小鼠腹外斜肌外膜通过显微外科技术制备成中空神经导管,并成功通过桥接移植肌外膜神经导管修复了小鼠坐骨神经缺损。肌外膜组织易于获取,供区肌肉无功能损伤,考虑到单纯的肌外膜组织生物学力强度不足支撑管腔形状,且往往与肌纤维组织链接紧密难以彻底分离,因此我们获取肌外膜时会附带少量肌纤维,这些平行排布的肌纤维对神经轴突的延伸具有一定导向性,且其中含有的多种活细胞成分、细胞因子以及纤维支架结构等均使其成为较为理想的神经导管材料来源[5]。我们希望通过在肌外膜导管内添加种子细胞,以提高其修复能效,探究更深层的作用机制。在挑选适当种子细胞的过程中,我们注意到了骨骼肌来源干细胞（MDSCs）,MDSCs是来源于骨骼肌组织中,具有跨胚层多向分化潜能的干细胞。研究证实,MDSCs在体外通过诱导可向肌细胞、雪旺细胞、成骨细胞、血管内皮细胞以及造血细胞等方向分化[6-8],即具有多胚层分化的潜力,同时分泌多种细胞生长因子如IGF、NGF、b-FGF、VEGF[9,10]等。而在体内研究中,通过移植MDSCs则可促进肌肉、肌腱、血管、骨、软骨及神经等组织再生[8,11,12]。考虑到肌外膜导管与MDSCs来源的一致性,我们猜想将MDSCs作为种子细胞,与肌外膜神经导管共同构建肌源性组织工程神经,可以相互促进对损伤神经的促再生作用,并且将进一步探索MDSCs作为种子细胞在组织工程领域的应用潜力。研究目的:1.寻找并获取肌源性人工神经的种子细胞2.将肌外膜导管与种子细胞结合,构建肌源性人工神经导管,并从组织学、神经功能等方面评价其修复效率3.分析种子细胞相关促进周围神经修复的具体机制实验方法和结果:1.改良传统的多次贴壁培养法,寻找更合理的肌源性干细胞获取途径方法:根据既往文献,尝试通过传统多步贴壁法获取MDSCs,发现这种方法获取细胞效率低下,难以满足研究需要。因此我们通过改变培养基及培养环境等方式,提出了改良多步贴壁培养法,并从细胞形态、细胞增殖曲线、细胞相关标记物鉴定等方面评价了两种培养方法。结果:改良培养法能减少重复贴壁的时间,更为高效、简便地获取MDSCs。两种方法所得MDSCs均表达相关肌源性干细胞标记物,且随着重复贴壁过程,相关标记物阳性率逐渐升高。2.对骨骼肌来源的不同细胞亚群成神经分化能力进行评估方法:骨骼肌组织消化培养可得到多种不同的细胞群,其相关细胞特性具有较大差异,根据细胞贴壁时间的不同可通过多步贴壁将不同细胞群分开。我们将不同贴壁时间的细胞群进行成神经分化诱导,随后通过细胞形态学、免疫荧光染色、Real—time PCR等方法评价不同细胞群的成神经能力,寻找更合理的肌源性人工神经种子细胞。结果:改良培养法所得末次贴壁细胞群（PP2）相比前期贴壁的细胞群（PP1）在成神经诱导处理后,形态学特征改变更显著,神经相关蛋白的表达量更高,因此PP2比PP1具有更强的成神经分化能力,成为后续实验的种子细胞。3.构建肌源性人工神经修复小鼠坐骨神经缺损方法:通过手术切除小鼠一侧坐骨神经3mm,形成约5mm长的神经缺损。取小鼠腹外斜肌外膜,通过显微外科技术构建约7mm长,内径0.7mm的肌外膜导管,桥接修复神经缺损。随后在管腔内注入混合GFP—MDSCs的Matrigel,支撑管腔形态,对照组仅注入Matrigel不添加MDSCs。结果:成功通过显微外科技术构建肌源性人工神经,桥接修复小鼠坐骨神经缺损模型,术后实验动物均情况良好。4.对肌源性人工神经的修复效率进行评价方法:修复手术后,我们每两周对小鼠的坐骨神经指数（SFI）进行测量,同时还通过Von Frey实验评估痛触觉的恢复情况。术后第四周和第八周,分别取材,对再生神经进行免疫荧光染色、masson染色、甲苯胺蓝染色、透射电镜等组织学实验,分别从神经功能学及组织学方面评价其坐骨神经再生情况。结果:在术后八周时,两组实验动物坐骨神经均表现出不同程度的再生。添加了 MDSCs的实验组,其坐骨神经指数恢复曲线、痛触觉评价实验等,均显著优于不添加MDSCs的对照组,腓肠肌的去神经萎缩情况也更轻微。在组织学检测中,实验组的再生髓鞘厚度及有髓神经纤维直径均显著大于对照组,WB检测也显示实验组相关髓鞘蛋白表达量更高。5.分析MDSCs促进坐骨神经再生的相关机制方法:根据添加的MDSCs来源GFP小鼠,表达绿色荧光的特性,我们在术后四周及八周时取材,通过免疫荧光染色及对GFP阳性细胞的观察,对移植后的MDSCs进行示踪,分析其对坐骨神经修复的作用及相关机制。结果:根据GFP阳性细胞在不同时间点的分布情况,我们发现术后四周时,移植的GFP—MDSCs可以和肌外膜导管融合,分化构成肌纤维组织;术后八周时,可分化形成类髓鞘结构包绕再生神经轴突,此外还可分化形成类新生血管结构,由此促进损伤后坐骨神经的再生过程。研究结论:改良多步培养法可以便捷、高效的获取MDSCs,并且可以有效将肌源性细胞群分开,各细胞群在形态学、细胞生理特质、标记物表达情况及分化能力等方面均具有显著差异。而MDSCs作为种子细胞添加到肌外膜导管中修复小鼠坐骨神经缺损,其多向分化能力可以促进再生轴突成熟化、帮助新生髓鞘和血管形成,从而帮助小鼠运动及感觉功能恢复,提高肌外膜神经导管的促神经修复效能,是一种极具潜力的神经组织工程种子细胞。