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第一部分过表达和干扰LSD1的慢病毒载体构建和鉴定目的构建和鉴定过表达和干扰LSD1慢病毒载体,为进一步的实验研究奠定基础。方法1.采用PCR技术从LSD1cDNA克隆质粒中钓取LSD1基因,并将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒GV166中,构建慢病毒载体表达质粒GV166-LSD1,通过PCR鉴定、测序比对目的基因LSD1,用GV166-LSD1转染293T细胞后Western Blot检测LSD1蛋白的表达,将GV166-LSD1质粒和包装质粒pHelperl.0、 pHelper2.0共转染293T细胞,包装和生产携带LSD1基因的重组慢病毒LV-LSD1,测定病毒滴度。LV-LSD1感染LNCaP细胞后,Real-time定量PCR和Western Blot检测LSD1基因mRNA和蛋白的表达水平。2.LV-LSD1-感染LNCaP细胞后,通过puromycin抗性压力筛选过表达LSD1的单克隆稳定株LNCaP-LSD1细胞,定量PCR和Western Blot检测LNCaP-LSD1细胞LSD1基因mRNA和蛋白的表达水平。3.根据权威文献验证过的LSD1基因siRNA干扰靶点序列,构建shRNA慢病毒(Lentivirus, LV)表达质粒,并进行PCR鉴定和测序比对,将GV307-LSD1-shRNA质粒载体及包装质粒pHelperl.0、pHelper2.0共转染293T细胞,进行病毒包装成LV-LSD1-shRNA,并进行滴度测定；LV-LSD1-shRNA感染LNCaP-AI细胞后,Real-time定量PCR和Western Blot检测LSD1基因mRNA和蛋白的表达水平。结果1.成功构建过表达LSD1慢病毒载体LV-LSD1,病毒滴度为2.0E+8TU/ml, LV-LSD1感染LNCaP细胞后,其LSD1mRNA和蛋白的表达水平明显升高。2.筛选出过表达LSD1的单克隆稳定株LNCaP-LSD1细胞,其LSD1mRNA和蛋白的表达水平升高。3.构建出干扰LSD1表达慢病毒载体LV-LSD1-shRNA,病毒滴度为5.0E+7TU/ml, LV-LSD1-shRNA感染LNCaP-AI细胞后,其LSD1mRNA和蛋白的表达显著降低。结论成功构建过表达LSD1慢病毒载体LV-LSD1;成功筛选获得过表达LSD1的单克隆稳定株LNCaP-LSD1细胞,并在mRNA和蛋白表达水平验证了LSD1过表达；成功构建干扰LSD1的慢病毒载体LV-LSD1-shRNA,并在LNCaP-AI细胞产生了预期的干扰效应。上述成果为进一步研究LSD1在前列腺癌雄激素非依赖性表型转化中的作用及机制奠定实验基础。第二部分LSD1在前列腺癌雄激素非依赖性表型转化中的作用及可能机制目的探讨LSD1在前列腺癌雄激素非依赖性表型转化中的作用及可能机制。方法1.CCK-8法检测LNCaP-LSD1与LNCaP细胞在Bicalutamide处理后细胞增殖水平的差异,以及LSD1-siRNA、con-siRNA、Pargyline、Tranylcypromine处理后LNCaP和LNCaP-AI细胞的细胞活力的变化,以及以上处理联合R1881刺激后细胞数量的改变。2.定量PCR和Western blot检测LNCaP细胞和LNCaP-LSD1细胞AR mRNA和蛋白表达水平的差异；ELISA法检测LNCaP细胞与LNCaP-LSD1细胞在不同浓度Bicalutamide处理后PSA分泌水平的差异,并检测LSD1-siRNA、con-siRNA单独或与Bicalutamide联合处理后LNCaP-AI细胞PSA分泌水平的变化。3.FCM亚G1峰(sub G1)法检测Etoposide单独或与LSD1-siRNA、con-siRNA联合处理后LNCaP-AI细胞凋亡的差异；定量PCR和Western Blot检测LNCaP和LNCaP-LSD1细胞p53、p21和Bax mRNA和蛋白表达水平的差异,观察LSD1-siRNA处理后LNCaP-AI细胞p21和HDM2mRNA和蛋白的变化；Western Blot检测Con-siRNA和LSD1-siRNA处理后LNCaP-AI细胞的Bax. PUMA和survivin蛋白表达水平的差异。结果1. LNCaP细胞在在去雄激素环境或Bicalutamide阻断雄激素受体后增殖能力受到明显抑制,而LNCaP-LSD1细胞仍能持续增殖；LSD1-siRNA、Pargyline和Tranylcypromine处理后,LNCaP和LNCaP-AI细胞活力均明显降低；此外,LSD1-siRNA和Tranylcypromine抑制了R1881对LNCaP和LNCaP-AI细胞的促增殖效应。2. LNCaP细胞和LNCaP-LSD1细胞ARmRNA和蛋白表达水平的无明显差异；LNCaP-LSD1细胞PSA分泌水平显著高于LNCaP细胞,10μmol/L Bicalutamide显著降低LNCaP细胞PSA分泌水平,但对LNCaP-LSD1细胞PSA分泌水平无影响；Bicalutamide对LNCaP-AI细胞PSA分泌无影响,LSD1-siRNA处理使Bicalutamide重新获得了对LNCaP-AI细胞PSA分泌的抑制效应。3.LSD1-siRNA促进了Etoposide诱导的LNCaP-AI细胞凋亡,LNCaP-LSD1细胞p53mRNA和蛋白表达量与LNCaP细胞无明显差别,p21、Bax mRNA和蛋白表达量较LNCaP细胞明显减少;LSD1-siRNA增加了LNCaP-AI细胞p21和HDM2mRNA表达水平,LSD1-siRNA上调了LNCaP-AI细胞p21、HDM2、Bax和PUMA蛋白表达,下调了survivin蛋白的表达。结论LSD1可能在前列腺癌AI转化中扮演了重要角色。前列腺癌在雄激素剥夺环境中上调LSD1基因表达,LSD1通过活化AR信号通路,抑制p53依赖性凋亡通路,从而诱导前列腺癌获得AI表型。