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真菌毒素是指饲料受到真菌污染而产生的毒性代谢产物,对饲料和食品造成了严重的危害,动物摄入后会造成中毒反应。我国真菌毒素的污染问题十分严重,每年因农作物被真菌毒素污染而被弃去的饲料高达20%左右,造成了严重的经济损失。已发现的真菌毒素中,危害比较大的毒素主要包括:黄曲霉毒素(Aflatoxin Toxin,AFT)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)、T-2 毒素(T-2 Toxin,T-2)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)等。生长在大自然的谷物很容易受到多种真菌毒素的污染,两种或两种以上的真菌毒素共同存在时会产生联合作用或拮抗作用,但联合作用较为常见。这些作用对人和动物的健康造成了严重的威胁,所以选择方便有效的毒素检测方法很重要。常用的检测分析方法包括:薄层色谱法(Thin-Layer Chromatography,TLC)、高效液相色谱串联质谱法(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,HPLC-MS)、酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)。薄层色谱法的优点是操作方法简便,成本低,但处理样品的工作量较大,操作人员必须直接接触标准品,危害操作人员的健康。高效液色谱串联质谱法的检测仪器价格昂贵、而且样品前处理比较复杂,操作需要专门的技术人员,不适合用于大批饲料的检测。酶联免疫吸附法快速、灵敏,应用时需要多次洗涤,而且检测时间很长,无法满足现场检测的要求。因此,为了保证人和动物的健康,建立一种快速筛查和检测毒素的方法很重要。本课题以毒性较强、分布较广的黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和T2毒素为研究对象,采用免疫学原理建立了快速检测AFB1、DON、T-2的方法,主要研究内容如下:1、AFB1单克隆抗体的制备AFB1-BSA作为完全抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合和亚克隆,共获得10株能特异性分泌AFB1单克隆抗体(Monoclonal Antibody,mAb)的细胞株。选用1C10细胞株,用腹水法制备mAb,并对抗体的亚型、亲和力、交叉反应率进行鉴定。制备的AFB1 mAb浓度为0.8 mg·mL-1,IgG抗体的亚型为IgG1。2、AFB1、T-2、DON免疫层析试纸条的研制在已获得AFB1、DON、T-2三种真菌毒素mAb的基础上,研制了能同时检测三种真菌毒素的高灵敏、适用于现场检测的免疫层析试纸条。主要包括胶体金的制备、金颗粒大小的鉴定、胶体金与抗体用量比的确定、检测线上抗原的包被浓度的优化、多重免疫层析试纸条的组装等。T线消失时,饲料样品稀释液中最低毒素的浓度分别为:AFB1为2 ng·mL-1、T-2 为 20ng·mL-1、DON 为 100 ng·mL-1。3、免疫层析试纸条对实际样品的检测对研制的三联免疫层析试纸条专一性、灵敏度、可重复性、稳定性进行检测,该结果与高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)的检测结果相符合,则研制的免疫层析试纸条可以用于相关毒素的检测。利用本试验研制的免疫层析试纸条对山东、河南等饲料厂提供的186份饲料进行检测。检测结果显示,AFB1污染较为严重,为83%,DON污染次之,为56%,T-2为20%。