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[研究背景]血管内皮细胞既是循环和组织器官间的第一道屏障,也是许多心血管活性物质的主要来源,直接参与了心血管活动的调节,其功能是维持循环系统平衡和稳定的基础。内皮细胞的功能调节又有赖于一系列心血管活性物质,如血管内皮生长因子、内皮素、一氧化氮和血管紧张素Ⅱ等等。近年来研究发现的一种小分子调节物质microRNA,能够通过调控这些与内皮细胞功能密切相关的基因的表达而参与内皮细胞和血管功能的调节。尤其是一些血管内皮细胞特异性和高表达的microRNA,在血管的生理和病理生理过程中发挥着重要的调控功能。miR-125和miR-126是目前报道的与血管内皮细胞及血管功能密切相关的microRNA。研究表明,miR-125家族的两个成员：miR-125a和miR-125b在球囊损伤内皮引起内膜增生的血管中表达显著下降；而在单核巨噬细胞中,miR-125a能够为氧化低密度脂蛋白刺激所诱导表达增加,并能抑制单核巨噬细胞对脂质的摄取以及炎症因子的分泌,提示miR-125a/b参与了动脉粥样硬化疾病的血管炎症反应和血管内皮损伤及内膜增生等血管病理过程。miR-126是一种血管内皮细胞特异性表达的microRNA,它能够通过调控Spred-1、VCAM-1、HoxA9、v-Crk、EGFL-7和VEGF等基因的表达参与调节血管发育、新生血管形成以及血管炎症反应等血管的生理和病理生理过程。通过生物信学预测,我们发现：miR-125a和miR-125b可能调控内皮素-1 (Endothelin-1,ET-1)这一重要的心血管活性物质的基因表达,并可能藉此影响动脉粥样硬化和高血压等心血管疾病的发病过程；而由一种microRNA前体：pre-miR-126剪切生成的两种血管内皮特异性表达的microRNA:miR-126和miR-126*可能共同调控一种干细胞趋化因子：间质源性因子-1 (Stromal derived factor-1, SDF-1)的基因表达,影响组织干细胞向缺血组织和器官的迁移,进而参与心脑急性缺血损伤后的机体自身修复和重建过程。本课题利用多种microRNA的表达和功能研究方法,研究和探讨了这些科学问题。[实验方法]一、MicroRNA-125a/b抑制血管内皮细胞内皮素-1基因表达及机制1、利用microRNA定量PCR技术检测miR-125a和miR-125b在小鼠不同组织和细胞的表达分布,同时利用Western blot检测ET-1基因初级翻译产物：前内皮素原(ppET-1)在这些组织细胞中的表达。2、在H5V血管内皮细胞内转染pSuper-miR-125a和pSuper-miR-125b分别过表达miR-125a和miR-125b, Western Blot检测前内皮素原(ppET-1)的表达；利用miR-125a inhibitor和miR-125b inhibitor在血管内皮细胞分别下调miR-125a和miR-125b后,检测ppET-1表达,研究miR-125a/b对血管内皮细胞ppET-1表达的影响。3、构建携载ET-1基因mRNA 3’非翻译区的pGL3重组萤光素酶报告基因质粒,分别与pSuper-miR-125a和pSuper-miR-125b共转染293A细胞,检测萤光素酶的活性；明确miR-125a和miR-125b调控ET-1基因表达的机制。4、分别利用10μg/ml氧化低密度脂蛋白刺激H5V和b.END3两种血管内皮细胞6、12、24、36和48小时,定量PCR检测miR-125a和miR-125b的表达变化,同时利用Western Blot检测ppET-1的表达变化。通过转染pSuper-miR-125a和pSuper-miR-125b在H5V血管内皮细胞内分别过表达miR-125a和miR-125b后,再利用10μg／ml氧化低密度脂蛋白刺激上述转染的细胞24小时,检测细胞总蛋白中ppET-1的表达以及培养上清液中ET-1的含量,明确miR-125a/b对氧化低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞ET-1表达的影响。5、检测6周龄SHR-SP大鼠和WKY大鼠主动脉中miR-125a、miR-125b和ET-1的表达。二、血管内皮miR-126／126*通过抑制SDF-1的表达调控骨髓间充值干细胞的迁移1、利用microRNA定量PCR方法检测miR-126和miR-126*在小鼠不同组织和部分细胞中的表达分布；并检测低氧培养和氯化钴两种模拟缺氧的理化刺激条件下H5V血管内皮细胞中miR-126和miR-126*的表达变化,以及小鼠急性脑缺血模型脑组织中miR-126和miR-126*的表达变化。2、在血管内皮细胞,通过转染pSuper-miR-126同时过表达miR-126和miR-126*随后对血管内皮细胞进行低氧培养,Western blot检测SDF-1蛋白表达变化,研究miR-126和miR-126*对低氧诱导SDF-l表达的影响；通过共转染miR-126 inhibitor和miR-126* inhibitor同时下调miR-126和miR-126*的表达,检测SDF-1蛋白的表达,研究在生理条件下下调血管内皮细胞miR-126和miR-126*对SDF-1表达的影响。同时利用ELISA检测上述实验中细胞培养上清液SDF-1的含量。3、构建携载SDF-1基因mRNA 3’非翻译区的pGL3重组质粒,并分别对SDF-1基因mRNA 3’非翻译区上预测的miR-126和miR-126*的作用靶序列进行突变,得到两种突变型的pGL3重组质粒。通过将pSuper-miR-126、miR-126 mimic以及miR-126* mimic分别与这三种pGL3的重组质粒共转染293A细胞,检测共转染后重组萤光素酶报告基因的活性,研究miR-126和miR-126*对SDF-1基因mRNA3’非翻译区上各自预测靶位点的功能作用。4、分别利用miR-126 mimic和miR-126* mimic转染血管内皮细胞同时或单独过表达miR-126和miR-126*,检测SDF-1的表达变化。利用miR-126 inhibitor和miR-126*inhibitor在血管内皮细胞同时或单独下调miR-126和miR-126*,检测SDF-1的表达变化。研究单独或同时过表达和下调miR-126及miR-126*对SDF-1表达的影响及二者的相互关系。5、鉴于SDF-1对干细胞的趋化功能,在H5V血管内皮细胞过表达miR-126和miR-126*后对其进行低氧培养,利用体外Transwell迁移实验研究miR-126和miR-126*对骨髓间充质干细胞(MSC)向缺氧血管内皮细胞迁移的影响[结果]一、MicroRNA-125a/b抑制血管内皮细胞内皮素-1基因表达及机制1、miR-125a和miR-125b主要表达于小鼠的肺、脑和主动脉这些富含血管和血管内皮细胞的组织。在小鼠不同细胞中,miR-125a和miR-125b均高表达血管内皮细胞,miR-125b还高表达于血管平滑肌细胞。ppET-1主要表达于肺和主动脉组织,相对高表达于成纤维细胞和血管内皮细胞。2、在H5V血管内皮细胞内转染pSuper-miR-125a和pSuper-miR-125b分别过表达miR-125a和miR-125b后,能够显著抑制ppET-1蛋白的表达；而利用miR-125ainhibitor和miR-125b inhibitor在血管内皮细胞分别下调miR-125a和miR-125b,能够诱导ppET-1的表达。3、将pSuper-miR-125a和pSuper-miR-125b两种microRNA表达质粒分别与携载ET-1基因mRNA 3’非翻译区的pGL3重组萤光素酶报告基因质粒共转染293A细胞,二者均能够显著抑制重组萤光素酶报告基因的活性。4、利用氧化低密度脂蛋白刺激H5V血管内皮细胞后,miR-125a在刺激后6小时显著升高(>4倍),随后逐渐回落至正常水平；而miR-125b则在刺激后显著降低,于刺激24小时后降低最为明显；ppET-1则在刺激后6小时表达增加,于刺激后24小时升高最为明显。在H5V血管内皮细胞内分别过表达miR-125a和miR-125b均能够显著抑制氧化低密度脂蛋白诱导的ET-1表达和分泌的增加。5、与WKY相比,miR-125a和miR-125b在SHR-SP的主动脉中表达显著降低,而ET-1的表达显著升高。二、血管内皮miR-126／126*通过抑制SDF-1的表达调控骨髓间充值干细胞的迁移1、验证了miR-126是一种血管内皮细胞特异性高表达的microRNA,同时也证明miR-126*也是一种血管内皮细胞特异性高表达的microRNA;并且发现低氧培养和氯化钴刺激均不影响HSV血管内皮细胞中miR-126和miR-126"的表达,而在小鼠急性脑缺血模型脑组织miR-126和miR-126’表达均下调。2、在血管内皮细胞同时过表达miR-126和miR-126*能够显著抑制低氧所诱导的SDF-1表达增加和分泌,而同时下调miR-126和miR-126*则能够显著诱导SDF-1的表达和分泌。3、利用pSuper-miR-126和miR-126/126* mimic同时和分别过表达miR-126和miR-126’均能够抑制携载野生型SDF-1基因mRNA 3’非翻译区的萤光素酶报告基因表达,而将SDF-1基因mRNA 3’非翻译区上miR-126和miR-126*的靶位点突变后,miR-126和miR-126"对重组萤光素酶报告基因的抑制作用消失。4、在血管内皮细胞单独过表达miR-126和miR-126*并不能抑制低氧所诱导的SDF-1表达增加,而单独下调miR-126和miR-126"也不能诱导SDF-1的表达,只有同时过表达或下调miR-126和miR-126*才能够抑制或诱导SDF-1的表达；同时过表达miR-126和miR-126*对携载野生型SDF-1基因mRNA 3’非翻译区的重组萤光素酶报告基因的抑制作用比分别单独过表达二者更为显著。5、在血管内皮细胞利用pSuper-miR-126和miR-126/126* mimic同时过表达miR-126和miR-126*能够显著抑制低氧诱导的MSC向缺氧血管内皮细胞的迁移；同时下调miR-126和miR-126*则能够诱导MSC向血管内皮细胞的迁移。[结论]1、miR-125a和miR-125b均为血管内皮细胞高表达的microRNA。2、miR-125a和miR-125b能够通过作用于ET-1基因mRNA 3’非翻译区上特异性靶位点抑制ET-1基因的表达,并可能藉此参与ox-LDL刺激对血管内皮细胞ET-1的表达调控以及SHR-SP大鼠血压的调节。3、miR-126和miR-126*均为血管内皮特异性高表达的microRNA。4、miR-126和miR-126*能够作用于SDF-1基因mRNA 3’非翻译区上各自特异性靶序列抑制血管内皮细胞SDF-1的表达和分泌,二者作用具有协同效应。5、miR-126／126*能够通过抑制SDF-1的表达调控骨髓间充质干细胞向缺氧内皮细胞的迁移。