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水稻斑点叶突变体是一类特殊的遗传材料,对探究水稻细胞程序性死亡、过敏性反应及抗病调控机理等具有重要意义。水稻斑点叶突变体Spl34（Spotted leaf 34）是从两个正常绿叶材料粤晶丝苗2号和H4的F2群体中获得的自然突变体。前人已对突变体Spl34进行了遗传分析和基因初步定位,表明Spl34斑点叶表型受一个显性基因Spl34（t）调控,利用F2（02428/Spl34）群体将其初步定位于第11号染色体19.84-22.48Mb区间。在此基础上,本研究进一步对突变体Spl34的农艺性状和理化指标进行鉴定,并利用SSR/InDel标记及高通量测序对斑点叶基因进行精细定位,同时对定位区间的序列进行比较研究。所取得的主要结果如下:1、突变体Spl34主要农艺及品质性状未受到斑点性状的不利影响。以F8代Spl34单株分离的无斑点植株为对照（CK）,田间表型调查发现Spl34与CK相比未出现早衰现象,两者农艺性状没有明显差异。稻米品质分析发现,突变体Spl34和CK的整精米率在0.01水平上差异显著,其他指标没有显著差异。种子活力鉴定表明,突变体Spl34与CK的发芽率、发芽势出现差异。2、突变体Spl34斑点的出现对生理生化指标的影响。紫外光照射试验表明,Spl34的斑点可能是由紫外光诱导产生的某种未知色素积累引起。开花期Spl34的SPAD值和可溶性蛋白均低于对照,并且下降速度较快。田间光合作用测定结果表明,开花期突变体Spl34的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均低于对照,表明突变体Spl34植株斑点的出现可能影响到了水稻叶片的光合作用。NBT和DAB的染色试验结果显示,突变体Spl34叶片染色后斑点部位仍然是褐色,因此推测Spl34比对照有更强的抗氧化能力。3、突变体Spl34斑点叶性状受单显性基因控制,利用SSR/InDel标记将该基因精细定位于第11染色体46.99kb范围内。前期研究所用的F2（02428/Spl34）群体较小,而且部分晚熟单株的斑点叶表型不够明显,无法满足精细定位Spl34（t）的需求。因此,本研究利用粳稻Francis和Spl34杂交构建了F2基因定位群体,用于斑点叶基因的精细定位研究。遗传分析表明,F2（Francis/Spl34）群体有无斑点植株的比例符合3:1的分离比,进一步确认Spl34的斑点叶表型受单个显性基因Spl34（t）调控。以日本晴基因组为参考序列,利用SSR/InDel标记对无斑点叶隐性单株进行连锁分析,将Spl34（t）精细定位于第11号染色体23.483-23.530 Mb之间,定位区间长度为46.99 kb,包含8个已注释基因。以该区间内日本晴8个基因的序列为参考设计引物进行扩增,Spl34和对照均无法获得扩增产物,而日本晴和Francis均能够获得特异产物。因此,推测定位区间内Spl34和日本晴的序列存在很大差异,无法以日本晴序列为参考筛选出Spl34（t）的候选基因。4、利用BSA-seq与单分子测序对突变体基因组从头组装,进一步缩小定位区间至40kb。利用Illumina高通量测序技术,对F2（Francis/Spl34）的有斑点个体混合池、无斑点个体混合池以及双亲进行重测序。利用基因组SNP对有斑点和无斑点混合池进行关联分析,将Spl34（t）定位于第11染色体23,223,221 bp至23,791,314 bp之间,区间大小约568 kb。进一步利用单分子测序技术对Spl34突变体进行测序,通过从头组装产生4290个大于10 kb的重叠群,平均长度61.97 kb,累加总长度达到265.86 Mb。以此为参考,对混合池进行BSA关联分析,在两个重叠群tig00001409和tig00003011检测到紧密连锁。进一步将两个重叠群的局部序列在日本晴基因组上进行Blast,发现两个重叠群分别与日本晴chr11:23.46-23.51 Mb两侧序列高度一致。通过对两个重叠群之间序列进行Sanger测序填补gap,产生的新重叠群长度达到233.95kb,其中Spl34（t）定位区间大小约为40 kb。定位区间内,Spl34突变体与对照的扩增产物,存在明显的片段长度差异。在前人研究基础上,本研究进一步明确了斑点叶突变体Spl34的表型及生化指标,同时利用基于高通量测序的基因定位方法将斑点叶基因Spl34（t）精细定位于第11染色体约40kb的区间,为该基因的进一步功能研究奠定了良好基础。