A型流感病毒是引起流感疫情的主要病原,有时会引发严重的呼吸系统疾病,其流行往往伴随着显著的发病率及死亡率。A型流感病毒为囊膜病毒,属于正粘病毒科,基因组由8股负链RNA节段组成。病毒核糖核蛋白(vRNP)复合物是病毒的核心成分,主要由三种聚合酶蛋白(PB1、PB2、PA)、核蛋白(NP)和病毒RNA(vRNA)组成,在流感病毒转录和复制过程中发挥着重要作用。NP由第5条RNA节段编码,是病毒粒子中丰度较高的蛋白。在流感病毒感染期间,NP的亚细胞定位、寡聚化、与vRNP其它组分相互作用等是调节病毒聚合酶活性和病毒复制能力的重要因素。NP上存在着一个尾环结构,将这个环插入到相邻NP分子主体的结合槽内部,介导NP的寡聚化,参与vRNP复合物的形成。NP可以与病毒聚合酶蛋白PB1、PB2相互作用,但不与PA结合。而且NP具有较高的RNA结合活性,结合RNA无序列特异性。NP促进vRNP入核,也在vRNP出核过程中起一定的作用。核输出信号(Nuclear export signals,NESs)和核定位信号(Nuclear localization signals,NLSs)在调控NP核质穿梭中起主要作用,我们的前期研究显示NP上含有两个出核因子(Chromosome maintenance protein 1,CRM1)非依赖的 NESs(NES1 和 NES2)和一个CRM1 依赖的 NES(NES3)。病毒感染真核细胞过程中,丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸经常发生磷酸化和去磷酸化。磷酸化和去磷酸化修饰通过调控病毒蛋白功能,在病毒复制周期中发挥重要作用。有的磷酸化能够激活蛋白活性,相应去磷酸化抑制蛋白活性,或者反过来也有可能去磷酸化开启蛋白活性,磷酸化关闭蛋白活性。目前已发现多个A型流感病毒蛋白的磷酸化位点。本研究深入探索了 NP磷酸化和去磷酸化对其自身功能的影响及其对流感病毒复制的调节机制。以A型流感病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株(WSN)为研究对象,通过磷酸化质谱实验鉴定出NP上未报道的一个磷酸化位点,188位苏氨酸(T188)。生物信息学和功能性分析显示,T188位于NP非CRM1依赖的NES2上,该位点及其连接区域在A型和B型流感病毒毒株中均高度保守且具备表面可及性。将T188位突变为谷氨酸(E)模拟持续磷酸化,突变为丙氨酸(A)模拟持续去磷酸化,利用间接免疫荧光实验和细胞计数发现T188磷酸化能够抑制NES2依赖的NP出核,并且NP T188磷酸化抑制了病毒的聚合酶活性。反向遗传系统拯救NP T188突变病毒,利用western blotting和real-time PCR检测NP和M1蛋白的表达水平,发现T188突变病毒的蛋白水平和基因水平与野生型病毒均有不同程度的下降。取细胞上清检测病毒滴度,绘制病毒的多步生长曲线,结果显示T188A突变病毒的复制能力有所下降,而T188E的突变病毒未能拯救成功,表明该位点对于病毒包装至关重要。将T188A突变或野生型病毒利用滴鼻法接种小鼠模型,检测体重变化、死亡率、肺病变、肺指数和肺组织中的病毒滴度,发现T188A突变病毒的致病力和复制能力均有所下降。以上研究表明NP T188磷酸化和去磷酸化在流感病毒复制周期发挥了重要的调节作用。同时,我们通过质谱实验还鉴定出WSN毒株NP上另外一个未报道的磷酸化位点,69位丝氨酸(S69),生物信息学分析显示S69在A型流感病毒不同亚型中高度保守。点突变构建含NP S69模拟持续磷酸化和模拟持续去磷酸化的质粒,反向遗传系统拯救病毒,利用细胞和小鼠模型检测该位点磷酸化和去磷酸化对病毒复制和致病力的影响,发现NP S69磷酸化和去磷酸化能够抑制病毒蛋白表达和病毒复制效率,并且S69磷酸化降低了病毒聚合酶活性及病毒RNA的转录和复制水平。进一步检测了 NP S69突变对NP与病毒聚合酶蛋白的相互作用、NP与RNA结合、NP自聚化的影响,发现S69磷酸化减弱了 NP与PB2的相互作用。此外还检测了 NP S69突变对NP细胞内定位的影响,发现S69磷酸化抑制了 NP入核,提示S69磷酸化和去磷酸化通过调节NP与PB2结合活性和NP入核来影响病毒聚合酶活性,进而影响病毒的复制。综上所述,本研究发现NP T188位点的磷酸化和去磷酸化通过影响NES2依赖的NP出核和病毒的聚合酶活性调节A型流感病毒的复制,而NP S69位点的磷酸化和去磷酸化通过影响NP与PB2的结合活性、NP入核及病毒的聚合酶活性而影响病毒复制。本研究将有助于阐明A型流感病毒致病机理,为抗流感药物的研发提供新的靶点和理论依据。