论文部分内容阅读
细胞色素P450BM-3(CYP102A)是一种单加氧酶,具有脂肪酸羟基化活性。野生型P450BM-3酶能催化长链饱和或不饱和脂肪酸。经过蛋白质改造,P450BM-3酶催化底物的范围扩展至烷烃、环烷烃等,其中P450BM-3(A74G/F87V/L188Q)可以催化吲哚进行羟基化反应。本研究为了改善P450BM-3酶的催化活性和热稳定性,并扩展酶的底物谱,采用半理性设计方法,对P450BM-3进行了蛋白质工程改造,得到了多个催化性能得到改善的突变酶,并对突变酶的结构与功能关系进行了分析。首先,以P450BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G)为亲本,利用B-FITTER分析方法对P450BM-3的458个氨基酸进行b-factor值测定,筛选对热稳定性最可能产生影响的位点,并结合蛋白质的三维结构将位点控制在底物通道入口最终确定突变位点,而后对该位点进行定点饱和突变,从而进一步筛选出催化活力或热稳定性得到提高的突变酶P450BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G/G46S)(以下简称为突变酶G46S)。对突变酶的基本酶学性质进行研究发现,该突变酶的半失活温度(T5010)比亲本酶提高了5℃(达到48℃)；在50℃的半衰期t1/2比亲本酶延长了一倍；突变酶Km降低了22%,Kcat,提高了90%,催化效率kcat/Km(67.42min-1·mM-1)比亲本提高了1.48倍。第二,以P450BM-3(A74G/F87V/L188Q)为亲本,对46位点进行了定点饱和突变,以进一步考察该位点对于对P450BM-3催化功能的影响性质。结果发现,从46位残基的定点饱和突变文库中筛选得到了6个催化吲哚形成靛蓝活力得到提高的突变酶P450BM-3(A74G/F87V/L188Q/G46N)(以下简称为G46N突变酶,N指代不同的氨基酸)G46Y、G46E、G46W、G46R、G46V和G46S突变酶(其中G46S突变酶区别于第一部分的突变酶G46S)。其中,催化效率提高最多的是G46W突变酶,其催化效率接近于亲本酶的7.03倍。同时发现,G46E、G46Y和G46W突变酶不仅催化吲哚羟基化能力提高,其热稳定性也得到了提高。第三,为了拓展P450BM-3的催化专一性、得到可以催化甾醇类底物羟基化反应的突变酶,对P450BM-3进行了进一步的半理性改造。利用hotspot软件分析可能影响酶专一性改变的位点,然后通过Swiss-model在线模拟蛋白质的三维结构构建序列突变酶,筛选出对于底物通道入口结构有所改变的突变方式,最终得到以P450BM-3(A74G/F87V/L188Q)为亲本,蛋白质的N端截断20个氨基酸的突变酶(以下简称为-20突变酶),然后通过定点突变构建了真实的-20突变酶,进并对其催化甾醇类物质羟基化反应的性质进行了考察。虽然最终没有获得可以催化甾醇类物质羟基化的P450BM-3突变酶,但为采用分子设计手段构建可催化甾醇底物的P450BM-3工程酶进行了有益的尝试。本研究应用半理性分子设计手段对P450BM-3进行了多方面的改造研究,获得了多个催化性能得到改善的突变酶。这不仅为P450BM-3的应用提供了更好的突变酶,也丰富了对P450BM-3结构-功能关系的认识,同时对包括酶的半理性分子设计与改造提供了参考案例和理论借鉴。