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BRD7是我室通过cDNA代表性差异分析方法自主克隆的一个bromodomain蛋白家族新成员，具有逆转鼻咽癌细胞恶性表型，抑制鼻咽癌细胞生长的功能，是一个鼻咽癌候选抑瘤基因强有力的候选者。BRD2是通过酵母双杂交技术从人胎脑的cDNA文库中筛选出来的一个BRD7交互作用蛋白，并得到了免疫共沉淀和亚细胞共定位技术的进一步证实。BRD2又名Ring 3，属Ⅱ型组织相容性抗原家族人员，是一个细胞周期依赖型的蛋白激酶，具有明显的蛋白激酶活性，在果蝇发育和人类生长调控中起重要作用。BRD2与BRD7同属bromodomain蛋白家族成员。该家族的大多数成员参与了组蛋白的乙酰化作用，并证实了一些bromodomain蛋白是核转录因子，参与基因的转录调控，与多种肿瘤发生密切相关。BRD2在鼠的成纤维细胞BALB中主要定位于细胞核，其C末端含有一富含碱性氨基酸残基的典型核定位信号序列(NLS)—KKKKRKAEKHR。核定位信号序列是转录因子或其它核蛋白胞浆向胞核移位的结构基础，在蛋白中入核转运和功能调节中发挥十分关键的作用。同时我室前期研究通过GFP介导的亚细胞定位方法和流式细胞术证实BRD2具有细胞调亡始动功能。本研究旨在一方面研究BRD2核定位信号的核定位功能，另一方面初步研究BDR2细胞凋亡始动功能的结构基础和分子机制。具体实验结果如下：第一部分BRD2核定位信号的核定位功能1．BRD2在不同细胞系中亚细胞定位模式BRD2是BRD7的一个交互作用蛋白，多方面的证据支持其功能与BRD7密切关联。通过构建含绿色荧光蛋白(GFP)标签的BRD2真核表达载体pEGFP-C3／BRD2，应用GFP介导的亚细胞定位方法，分别考察BRD2在COS7、HeLa和HNE1三种细胞系中的亚细胞定位模式。结果表明BRD2在三种细胞系中均定位于细胞核，以片状或点状分布，相对均匀，没有明显的细胞种属特异性。但发现在BRD2转染的COS7、HeLa和HNE1中，许多细胞出现细胞核不规则、浓缩、碎裂等细胞凋亡的现象，其中以COS7和HeLa细胞最为明显，支持BRD2在上述细胞中具有细胞凋亡始动功能。2．BRD2不同截短体的亚细胞定位模式应用绿色荧光蛋白(GFP)介导的亚细胞定位方法，分别考察BRD2 N末端(aa 1-435)和C末端(aa 428-798)截短体在COS7、HeLa和HNE1三种细胞系中的亚细胞定位模式和差异。结果发现，BRD2 N末端和C末端均定位于细胞核，以片状或点状分布，相对均匀，没有明显的细胞种属和类型特异性。同时发现，在过表达BRD2C-末端(aa 428-798)的细胞中，出现细胞核不规则、浓缩、碎裂等凋亡现象的细胞明显比过表达BRD2 N末端(aa 1-435)的细胞多。3．BRD2一个新的非典型核定位信号序列的分离与鉴定BRD2是一个核转录蛋白，它在胞浆内合成后需要一个进入胞核的过程。在上述对BRD2不同截短体蛋白亚细胞定位的研究过程中，发现BRD2的N-末端和C-末端均定位于细胞核，提示在BRD2的两个不同截短体蛋白中分别至少存在一个核定位信号。文献已经报道在BRD2的氨基酸序列中发现了一个经典的NLS—KKKKRKAEKHR，该NLS位于BRD2的552-560位氨基酸，是决定BRD2 C-末端截短体蛋白入核的结构基础。但在BRD2的N-末端截短体蛋白中没有核定位信号序列的报道。通过www.expasy.ch对BRD2 N末端进行结构搜索，发现BRD2的275-282位氨基酸具有核定位信号序列(NLS)的特征，命名为pNLS。但通过构建pEGFP-C2／pNLS表达载体，发现这个假定的核定位信号pNLS不具有介导异源蛋白GFP胞核定位的功能，说明pNLS不是BRD2的核定位信号序列。进一步通过“步移法”，按照BRD2 N-末端的结构特征对BRD2 N-末端进行分区、分段，然后分别按阅读框架连接到pEGFP载体，通过GFP介导的亚细胞定位方法，发现BRD2 N-末端283-335位氨基酸具有介导异源蛋白GFP胞核定位的功能。同时通过胞浆、胞核蛋白分布抽提和Western blotting检测方法进一步证实了上述结果。说明BRD2 N-末端的283-335位氨基酸是BRD2 N-末端截短体蛋白入核的结构基础。生物信息学分析发现，该区域不具有经典核定位信号序列特征，是BRD2中一个非典型的核定位信号序列。第二部分BRD2细胞凋亡始动功能的结构基础和分子机制1．BRD2细胞凋亡始动功能的结构基础早期研究结果表明，BRD2具有细胞凋亡始动功能，但细胞凋亡始动功能的结构基础仍然不得而知。本研究在探讨BRD2不同截短蛋白的亚细胞定位时发现：尽管BRD2 N-末端(aa 1-435)和BRD2 C-末端(aa 428-798)均定位于细胞核，但在过表达BRD2 C-末端(aa428-798)的细胞中，出现细胞核不规则、浓缩、碎裂等凋亡现象的细胞明显比过表达BRD2 N-末端(aa 1-435)的细胞多，提示BRD2 C-末端在BRD2细胞凋亡功能中发挥关键作用。进一步通过Hochest 33258介导的细胞凋亡检测方法，发现在BRD2 C-末端过表达的COS7细胞中凋亡指数达到43％±8％，在HNE1细胞中的凋亡指数为4％±2％，与GFP空白载体相比存在显著差异(P＜0.05)。同时将pEGFP-C3／BRD2 C-ter表达载体瞬时转染COS7和HNE1细胞，通过流式细胞术对GFP阳性表达细胞进行凋亡检测，发现其凋亡百分数分别为38.5％和13.5％，进一步支持BRD2 C-末端在COS7和HNE1细胞中均具有细胞凋亡始动功能，是BRD2细胞凋亡始动功能的结构基础。该区域不含任何bromodomain结构域，说明BRD2细胞凋亡始动功能不依赖于bomodomain结构域而发生。但文献报道BRD2 C-末端存在一个核定位信号(NLS)，该NLS是否与BRD2细胞调亡始动功能存在功能性的关联，还有待于我们进一步研究。2．BRD2对细胞凋亡通路中关键靶分子表达水平的影响分别将pEGFP-C3／BRD2、pEGFP-C3／BRD2 C-ter和pEGFP-C3／BRD2 N-ter转染HNE1细胞，瞬时表达后通过Western Blot检测细胞凋亡通路中关键靶分子的表达。发现在BRD2和BRD2 C-末端截短体蛋白过表达的HNE1细胞中，p53，caspase 8和caspase 3的表达明显上调，bcl-2的表达明显下调；而BRD2的N-末端截短体蛋白对这些靶分子的表达水平没有明显影响。说明BRD2和BRD2 C-末端截短体蛋白的过表达能够在蛋白质水平上影响Fas介导的细胞凋亡通路中的关键靶分子的表达水平，从而导致细胞凋亡的启动。综上所述，本研究在前期确定BRD2为BRD7重要的交互作用蛋白的基础上，确定了BRD2在不同肿瘤细胞系或正常原代培养细胞系中的亚细胞定位模式，发现BRD2的N-末端和C-末端截短体蛋白均定位于细胞核，没有明显的细胞种属特异性；发现BRD2的283-335位氨基酸具有介导异源蛋白胞核定位的功能，是BRD2的一个新的非典型核定位信号序列；证实BRD2具有细胞凋亡始动功能，其C-末端(aa 428-798)是细胞凋亡始动能的结构基础，且不依赖于BRD2的bromodomain结构域而发生；BRD2及其C-末端截短体蛋白能分别影响细胞凋亡通路中关键靶分子p53、bcl-2、caspase-8和caspase-3的表达水平，说明BRD2可能通过Fas介导的凋亡通路参与细胞凋亡。