沙门氏菌的分离鉴定及PCR快速分型的研究

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沙门氏菌是监测食品卫生状况的重要指标菌,一旦发现食品污染沙门氏菌,表明监测的食品卫生不合格。常规的沙门氏菌检测存在操作繁琐、检测时间长、结果判定误差大等诸多弊端,因此利用现代生物技术将常规的生化反应结果通过现代信息化手段进行处理,克服了检验人员主观因素造成的误判,减少试验误差,提高细菌鉴定结果的准确率将显得十分必要。为有效预防和控制沙门氏菌的扩散蔓延,需对沙门氏菌的污染情况进行快速准确溯源,表型分型法已满足不了快速溯源的需要,难以适应检验检疫对生产企业进行全过程质量严密监管的发展,因此,选择使用快速、简便、分辨率高、重现性好的分子分型方法显得尤为重要。为此,笔者通过对从化地区进出口食品企业进行为期3年的沙门氏菌质量监控检测,对检出的沙门氏菌进行准确鉴定和快速分型研究,建立从化地区沙门氏菌分离株的生化鉴定、分子鉴定和分子分型数据,为监管部门对沙门氏菌污染过程的监管溯源提供技术参考以促进检验检疫把关服务。通过研究,得到如下主要结果:1.从从化地区13个品种共计564份进出口食品样品中初筛到11株可疑沙门氏菌,年平均检出率为0.65%,经生化试验、PCR检测和血清学试验鉴定为沙门氏菌,血清型有鼠伤寒、甲型副伤寒和肠炎三种分布类型。2.分离到沙门氏菌的样品主要为动物源性食品,这也从侧面反映出部分动物日常极易携带沙门氏菌。因此,企业应严防动物养殖期间的感染和屠宰加工过程中的污染,加工中应严格把关卫生质量,切实做好防范措施。3.对从化地区分离到的11株沙门氏菌进行ERIC-PCR分子分型,分成4类基因型,遗传相似性在56%~100%之间,显示出良好的多态性,获得了较好的指纹图谱数据,为下一步建立从化地区沙门氏菌分子分型数据库打下基础,为保障食品质量安全、维护国家利益并行使监管职权提供技术支撑。此方法可推广应用到其它致病菌的溯源调查。4.对实验的检测方法进行了优化:首先比较了不同DNA模板提取方法的差异,发现商业化的提取试剂盒提取的DNA不但纯度高,而且完整性保留较好,但费用较高;然后对沙门氏菌的ERIC-PCR的反应体系进行优化,得到的50μL最佳反应体系为:rTaqDNA聚合酶2.5U,d NTPs200μM,10×PCR buffer(15mM Mg2+Plus)5μL,DNA模板4μL,上下游引物(10μM)各3μL,无菌双蒸水30.5μL,最佳反应程序为:95℃预变性3min,30个循环(90℃变性30s,42℃退火1min,72℃延伸1min),72℃延伸8min。5.通过研究发现,就沙门氏菌而言,ERIC-PCR分型比血清分型分的更细,更适合污染的溯源调查。
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