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MicroRNAs (miRNAs)是近年来发现的一类新的非编码RNA,能通过转录后调控的调节方式抑制其靶基因的表达,在个体发育、肿瘤发生、干细胞分化和细胞凋亡等众多生物过程中发挥作用。近几年的研究已经发现了一些miRNAs能调控肌肉的生长发育。我室通过前期的研究工作发现了一批在猪骨骼肌发育不同时期存在差异表达的miRNAs,其中miR-214和miR-495主要在胚胎期的肌肉中高表达,在成年个体的肌肉中几乎不表达,而miR-133b在胚胎期和成年个体的肌肉中均高表达,到目前为止,这三个miRNA在肌肉发育中的功能还不明确。在本研究中,通过对miR-133b、miR-214或miR-495在C2C12中进行超表达或抑制表达研究,初步分析了每个miRNA在肌细胞的增殖和分化中的作用,同时对这三个miRNAs在肌细胞中调节的靶基因及相关的信号通路进行了初步的研究,取得了如下结果：(1)对miR-133b、miR-214和miR-495在C2C12细胞分化0天、1天、2天和4天等四个时期中的表达进行定量分析,发现miR-133b和miR-495在分化1天的细胞中的表达量均高于未分化的细胞中的表达量,并随着细胞的分化被显著上调,分化4天时,miR-133b的表达量是未分化细胞中表达量的25倍,miR-495的表达量是未分化细胞中表达量的7倍；但miR-214在分化1天的细胞中的表达量与未分化的细胞中的表达量没有显著差异,直到分化4天时miR-214的表达量才达到未分化细胞中表达量的2倍。(2)在C2C12细胞中超表达miR-133b后,细胞中处于G1期的细胞比例显著高于对照细胞(P<0.05),处于S期的细胞比例则显著低于对照细胞(P<0.05),,说明超表达miR-133b抑制细胞的增殖；抑制细胞中内源表达的miR-133b后,细胞中处于G1期的细胞比例显著低于对照细胞(P<0.01),处于S期的细胞比例则显著高于对照细胞(P<0.01),说明降低miR-133b的表达水平促进细胞的增殖；抑制分化的C2C12细胞中miR-133b的表达后,细胞中肌肉分化的标志基因myogenin和MyHC-2d的表达量均显著低于对照细胞中的表达量(P<0.01),说明降低miR-133b的表达抑制C2C12细胞的分化。(3)用xCELLigence系统分析miR-214在C2C12细胞增殖中的作用时发现,内源表达的miR-214被抑制的细胞,其细胞指数小于对照细胞,这代表抑制miR-214后细胞的增殖速度变慢,即抑制miR-214的表达会抑制C2C12细胞的增殖；抑制C2C12细胞中内源表达的miR-214表达后,细胞中处于G1期的细胞比例显著高于对照细胞(P<0.05),处于S期和G2期的细胞比例均显著低于对照细胞(P<0.05),这也表明降低miR-214的表达水平抑制了C2C12细胞的增殖,两种方法所得结果相吻合。抑制分化的C2C12细胞中miR-214的表达后,细胞中肌肉分化的标志基因myogenin和MyHC-2d的表达量均显著低于对照细胞中的表达量(P<0.05),说明抑制细胞中miR-214的表达对C2C12细胞的分化起抑制作用。(4)在C2C12细胞中超表达miR-495并将细胞诱导分化,分析其对C2C12细胞分化的影响。结果表明,超表达miR-495的细胞中myogenin的表达量显著高于对照细胞中的表达量(P<0.01),但MyHC-2d和Myh7在超表达miR-495和对照细胞中的表达量没有显著差异,因此miR-495是否能正调控肌细胞的分化还需要做进一步的探讨。(5)用TargetScan和PicTar软件对miR-133b、miR-214和miR-495进行预测,初步筛选出MAPK通路相关的靶基因：miR-133b可能作用的靶基因有FGFR1、ARHGEF9、Ppp2ca和Ppp2cb, miR-214可能作用的靶基因有FGFR1、MAPK8、CDGAP、ARHGEF9和Ppp2cb, miR-495可能作用的靶基因为MAPK10。通过荧光素酶报告基因试验初步确定miR-133b与FGFR1、ARHGEF9、Ppp2ca和Ppp2cb存在互作,进一步通过western blot验证了miR-133b在C2C12细胞中对FGFR1和PP2AC (Ppp2ca和Ppp2cb)表达的抑制作用。分析FGFR1和PP2AC在C2C12细胞分化0天、1天、2天和4天等四个时期的表达情况发现,FGFRl和PP2AC在mRNA水平的表达不随C2C12细胞的分化发生变化,但蛋白水平的表达均随着C2C12细胞的分化而逐渐被下调。(6)在分化的C2C12中超表达miR-133b后,细胞中ERK1/2的磷酸化水平低于对照,说明miR-133b对C2C12细胞中ERK1/2的磷酸化具有抑制作用；用ERK1/2通路抑制剂PD98059处理C2C12细胞后,细胞中miR-133b的表达被显著上调(P<0.01),这暗示ERK1/2的激活对miR-133b的表达起抑制作用。(7)用ERK1/2通路抑制剂PD98059处理增殖的C2C12细胞后,细胞的增殖被抑制,细胞中myogenin的表达显著上调(P<0.01)；用PD98059处理分化的C2C12细胞,处理20h和36h的细胞中myogenin和MyHC-2d的表达显著高于对照,但处理65h细胞中的myogenin和MyHC-2d的表达与对照没有显著差异。