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目的(1)建立两种高效的、可检测多种人巴贝西虫的核酸检测方法:实时荧光定量PCR和数字PCR,对两种方法进行评估并应用于检测血液样品;(2)用间接免疫荧光(IFA)、实时荧光定量PCR和数字PCR三种方法对牡丹江市无偿献血者血样分别进行血清学和核酸检测,评估其对当地输血安全的风险,为巴贝西虫对我国输血安全的风险提供数据支持。方法(1)实验方法建立:根据美国红十字会(AmericanRed Cross,ARC)HollandLaboratory的指导在本实验室建立间接免疫荧光检测(IFA)方法;从GenBank下载我国有研究报道的感染人巴贝西虫亚种的18S rRNA基因序列,并根据序列共同部分设计引物,全基因合成质粒,引物和质粒相互验证之后摸索并优化实验条件,然后进行重复性和灵敏度的评价,建立实时荧光PCR和数字PCR检测方法;(2)血液样品的处理:将1971份健康无偿献血者的全血样品离心,使其分离成红细胞和血浆两个部分,然后分装到不同的冻存管,然后红细胞样品10份/pool混样,完成之后-20 ℃保存备用;(3)无偿献血者的筛查:①IFA检测:检测对象为1971份无偿献血者血浆样品中的前1000份,用IFA法进行微小巴贝虫(Babesiamicroti)IgG检测;②实时荧光PCR检测:a.对全部1971份红细胞样品进行混样检测;b.对IFA检测阳性献血者进行单人份检测;③数字PCR检测:a.对1971份红细胞样品的后1000份进行混样检测;b.对IFA检测阳性献血者进行单人份检测。结果(1)成功建立实时荧光PCR和数字PCR检测方法,两种检测方法均有良好的特异性和重复性,但数字PCR比实时荧光PCR检测灵敏度高约10倍;(2)IFA检测:1000份血浆样本共检测到13例(1.3%)阳性样本,其中8例(0.8%)抗体滴度为1:64,5例(0.5%)抗体滴度为1:128;阳性样本的人口地理学信息统计分析结果表明,阳性样本在性别、年龄、民族等方面没有统计学差异(P<0.05);(3)qPCR检测结果:检测结果均为阴性;(4)ddPCR检测结果:1000份红细胞样品中共检测到2例(0.2%)核酸阳性样本,因阳性样本太少,未做人口地理学信息的统计分析;13例IFA检测阳性的样品中2例数字PCR核酸检测结果阳性,且均为1:128抗体滴度阳性样品。结论(1)成功建立两种高效的核酸检测巴贝西虫的方法:实时荧光PCR和数字PCR,为巴贝西虫相关研究提供技术支持,包括献血者筛查、分子流行病学研究、临床的诊断和监测、疾病感染机制和宿主免疫学等;(2)间接免疫荧光检测作为献血筛查是一种有效的检测手段,具有较高的特异性和敏感性,但与此相类似的、性价比更高的ELISA检测试剂盒的开发也是一个很有意义和价值的研究方向;(3)本研究首次证实牡丹江市存在人微小巴贝西虫感染的存在;本研究显示,牡丹江市无偿献血者中B.microti的血清阳性率为1.3%,巴贝西虫核酸阳性率为0.2%,显示巴贝西虫确实对该地区的采供血系统造成了一定的威胁,提示应当加强当地的献血者征询和筛查;(4)与牡丹江市一样同为巴贝西虫疫区的云南、浙江、河南信阳等地区,建议在蜱流行季节也进行无偿献血者中巴贝西虫的调查,评估其对当地输血安全的风险。