目前,大肠癌已经成为世界范围内危害人类健康的第三大杀手,并且近年来在中国呈逐年上升的趋势,因而成为我国卫生事业防治的重点,也是临床工作者研究的热点。肿瘤标志物的检测对大肠癌的诊断及治疗具有重要的指导意义,已成为临床诊治大肠癌一种常用的辅助手段。血清中CEA、CA199的检测已广泛应用于大肠癌的诊治中,但由于它们均属于糖链抗原,除大肠癌外,其他非胃肠道肿瘤和某些良性消化道疾病也可升高,因而特异性不高。寻找一种特异性及敏感性均较高的大肠癌肿瘤标志物,对大肠癌的早期诊断及早期治疗均具有重要的意义。此外,在大肠癌发病过程中,癌细胞的转移和扩散机制是另一个受人关注的焦点。目前的研究证实:微转移是一个独立的预后指标,其价值优于肿瘤分级的分期,微转移的检出是肿瘤复发的高风险因素,与临床分期和判断预后密切相关。然而,目前尚没有有关大肠癌淋巴结微小转移的肿瘤标志物蛋白组学的研究报道。因此,这一领域的研究是目前大肠癌研究的热点之一。最后,肿瘤标志物作为肿瘤治疗的靶标,在临床得到了广泛的应用,例如姜黄素就能调节P53水平,从而发挥抑癌作用,然而,其具体的治疗机制却不甚明了,阐明其作用机理对大肠癌的治疗具有重要的指导意义。本课题正是基于以上背景而提出的:首先,本课题对目前临床常用的几种大肠癌肿瘤标志物(CEA、P53、Ki-67及GST-π)进行了筛选,通过对标本的免疫组化染色及其与肿瘤临床生物学行为的相关性分析,找出与大肠癌诊断、预后及复发最密切相关的蛋白。随后,为了进一步明确与大肠癌转移相关的肿瘤标志物,本研究对大肠癌正常淋巴结及转移淋巴结进行了蛋白质组学的研究,通过比较这两组标本的蛋白电泳图,找出差异蛋白,并进一步对这些差异蛋白进行鉴定及分析,从而找出大肠癌转移相关蛋白。最后,本课题研究了肿瘤标志物作为分子靶标在大肠癌治疗中的作用,研究发现姜黄素能够降低肿瘤组织P53表达水平,从而促进肿瘤细胞的坏死,该研究结果为姜黄素应用于大肠癌的治疗奠定了理论基础,具有重要的指导意义。第一部分大肠癌肿瘤相关蛋白的免疫组化研究目的:探讨大肠癌常见肿瘤标志物(CEA、P53、Ki-67、GST-π)的表达与其生物学行为之间的关系,为大肠癌的诊断及其预后判断提供可靠的肿瘤标志物。方法:回顾性分析2004.1-2007.6我院收治的126例大肠癌患者的临床资料、病理资料及随访资料,对肿瘤石蜡标本采用免疫组化SP染色法检测CEA、P53、Ki-67、GST-π,分析其免疫组化特点及其与大肠癌临床生物学行为之间的关系,并采用统计学方法分析各独立指标间的相关性。结果:CEA、P53、Ki-67、GST-π在大肠癌切片中的阳性率依次为95.23%、55.56%、53.38%、82.30%。P53、Ki-67与肿瘤的Ducks分期和淋巴结转移有关,在C、D期的阳性表达率明显高于A、B期患者;P53、Ki-67、GST-π的表达与患者预后密切相关。P53、Ki-67表达之间呈现明显的正相关;GST-π和P53两者的表达呈正相关。P53、Ki-67在生存期>=1年的患者中的阳性率明显低于生存期<1年者。结论:大肠癌CEA、P53、Ki-67、GST-π表达与其发生、发展和浸润转移密切相关,联合检测对了解大肠癌的生物学行为和判断患者预后有一定的实用价值。第二部分大肠癌转移相关蛋白的蛋白质组学研究目的:大肠癌的转移严重影响着大肠癌的预后及复发,找出大肠癌转移相关蛋白对大肠癌的预后判断及治疗均具有重要的作用。本研究的目的就是通过前哨淋巴结与正常淋巴结的比较蛋白质组学研究,找出大肠癌转移相关蛋白。方法:研究对象为我院43名大肠癌患者,在手术过程中取出成对的正常淋巴结及转移淋巴结,并对标本进行HE染色及CK-IHC染色,从而对转移淋巴结进行确认。提取两组标本中的蛋白,并进行蛋白质组电泳分析,通过图像分析,找出两组差异表达的蛋白,并随后通过质谱分析和western blotting分析对差异蛋白进行身份确认,最后,对标本进行差异蛋白的免疫组化分析,研究它们在肿瘤组织中的表达情况。结果:通过HE染色及CK-IHC染色,我们对转移淋巴结进行了确认。随后的蛋白质组学电泳一共发现了40个差异表达的蛋白,其中有15个蛋白是上调的,而另外25个蛋白下调。进一步对这15个蛋白分析,发现他们根据功能不同可分为3组,而与肿瘤转移有关的蛋白只有4个:hnRNP A1, Ezrin, Tubulin beta-2C及Annexin A1,随后的质谱分析及western blotting对这4种蛋白进行了验证。最后的免疫组化分析发现:这4种蛋白在转移淋巴结中的表达要远远高于正常淋巴结。结论:hnRNP A1, Ezrin, Tubulin beta-2C及Annexin A1这4种蛋白在大肠癌转移淋巴结中呈高表达,它们是大肠癌转移的重要指示蛋白,可用于临床判断大肠癌淋巴转移。第三部分姜黄素调节P53表达抑制大肠癌转移的机制研究目的:姜黄素是从姜黄提取出来的一种有效成分,对大肠癌具有明显的抗肿瘤作用,而其确切的机制却不明确,可能与其能诱导细胞凋亡有关。本研究探讨了姜黄素与大肠癌P53表达之间的关系,从而为阐明姜黄素的抑癌作用提供可能的理论机制。方法:研究对象为我院126名大肠癌患者。实验分为两组,对照组病人为单纯手术组(63名),而实验组病人在等待手术的过程中接受了姜黄素治疗(63名)。所有病人在入院初始时均接受结直肠镜检查,并活检取标本(治疗前),同时取手术切除时的肿瘤标本(治疗后)。所有标本均采用TUNEL法检测各组中凋亡细胞,并通过提取总DNA比较肿瘤标本中细胞数量,对各组标本行P53免疫组化染色,并通过western blotting检测标本中Bcl-2及Bax的含量。另外,每日监测患者体重变化情况,并通过ELISA法监测血液中TNF-α变化情况。结果:实验组体重呈上升趋势,而对照组则逐渐下降。实验组血液中TNF-α水平逐渐下降,一个月后降为原来一半,而对照组则基本保持不变。免疫组化结果显示:实验组中凋亡细胞较对照组中明显要多,且实验组P53阳性率在治疗后明显下降,而对照组则没有明显改变。最后,western blotting结果显示:实验组在接受了姜黄素治疗后,其Bcl-2表达水平明显下降,Bax水平则明显上升;而对照组则没有明显变化。结论:我们的研究结果表明:姜黄素能够改善病人体重,降低血液TNF-α水平,从而改善病人恶液质;另一方面,姜黄素能够显著降低肿瘤组织P53表达水平,并调节Bcl-2及Bax表达水平,从而诱导肿瘤细胞凋亡,这可能正是姜黄素能够抑制肿瘤的机制所在。