目的:本研究室通过对鬼臼进行结构改造，得到一系列结构新颖的衍生物，其中YB-L1EPO在体外具有显著的抗多药耐药肿瘤活性，且具有良好的量效关系。本文进一步研究了YB-L1EPO对体外培养的多药耐药肿瘤细胞和动物移植性肿瘤的抑制作用及特点，并初步探讨了它的作用机制。　　 方法:　　 1、MTT法和SRB法检测YB-L1EPO的抗敏感肿瘤及多药耐药肿瘤活性。　　 用96孔培养板接种对数生长期的两株多药耐药肿瘤细胞（K562/A02和KBv200）、多种敏感的人源性肿瘤细胞和人的血管内皮细胞（VEC）及成纤维细胞（fb），培养24h后，加YB-L1EPO（10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L、0.01μmol/L），36h后MTT法和SRB法测定YB-L1EPO在体外对各种肿瘤细胞及正常细胞的IC50及GI50值。用SRB法检测药物对K562和K562/A02细胞生长曲线的影响。　　 2、光学显微镜、荧光显微镜观察YB-L1EPO作用后多药耐药肿瘤细胞形态结构改变。　　 在对数生长期K562/A02细胞中加入不同浓度YB-L1EPO，作用24h后进行Giemsa染色和Hoechst33342染色，前者用光学显微镜观察照相并保留结果；后者以紫外光（340nm）激发Hoechst，荧光显微镜观察照相并保留结果。　　 3、观察YB-L1EPO对动物移植性肿瘤的抑制作用。　　 昆明小鼠体内移植实体型S180肉瘤，接种S180肉瘤24h后，连续给YB-L1EPO（35mg/kg/d和70 mg/kg/d）6 d，于7d处死动物，剥离肿瘤并称重，观察YB-L1EPO对实体瘤S180肉瘤的治疗作用。　　 4、琼脂糖凝胶电泳分析YB-L1EPO对K562/A02细胞染色体DNA断裂的影响。　　 在对数生长期K562/A02细胞中加入不同浓度YB-L1EPO（0.05、0.1、0.2μmol/L）作用24h后抽提样本DNA，于1.5％琼脂糖胶电泳，电泳完成后用紫外光下观察并照相。D-24851（0.2μmol/L）作为阳性对照。　　 5、流式细胞术分析YB-L1EPO对K562/A02细胞周期的影响和诱导凋亡率的变化。　　 收集对数生长期K562/A02细胞，加入YB-L1EPO（0.1μmol/L和0.4μmol/L），用流式细胞仪检测不同浓度的YB-L1EPO作用24 h、36h和48 h后对K562/A02细胞的影响。　　 6、 RT-PCR法检测不同浓度YB-L1EPO（0.05、0.1、0.2μmol/L）对K562/A02细胞mdr-1、p53、bcl-2、bax、p21、caspase3mRNA表达的影响。　　 7、免疫组化法观察不同浓度YB-L1EPO（0.05、0.1、0.2μmol/L）对K562/A02细胞膜P-gp蛋白表达的影响。　　 8、Western-blot法检测不同浓度YB-L1EPO（0.05、0.1、0.2μmol/L）对K562/A02细胞P-gp蛋白质表达的影响。　　 结果:　　 1、YB-L1EPO的体外抗肿瘤作用　　 通过体外MTT和SRB方法发现YB-L1EPO对多种肿瘤细胞均有较好的抑制作用，IC50为0.04μmol/L～0.69μmol/L；而且抑制多药耐药肿瘤细胞的效果也非常显著。其对K562/A02和KBv200的GI50分别为0.08μmol/L和0.11μmol/L；单从体外的MTT结果来看，YB-L1EPO对癌细胞与正常细胞具有较好的选择性，对人的血管内皮细胞（VEC）和成纤维细胞（fb）的IC50均>10μmol/L。通过对K562/A02细胞生长曲线的观察，发现随着给药剂量的加大，YB-L1EPO对多药耐药肿瘤细胞的生长抑制作用越来越明显。YB-L1EPO的抗肿瘤活性与鬼臼毒素相当，IC50在同一数量级，且具有显著的抗多药耐药肿瘤细胞的活性。　　 2、YB-L1EPO的体内抗肿瘤作用　　 连续腹腔注射YB-L1EPO（35mg/kg/d及70mg/kg/d）10d，对小鼠实体型肉瘤S180的生长抑制率分别为33.6％和48.0％，大剂量和小剂量与对照组相比均具有显著性差异（P<0.05），且各剂量组小鼠体重与对照组小鼠体重无显著性差异（P>0.05）。说明YB-L1EPO在体内试验表现出良好的肿瘤抑制作用，且无明显毒副作用。　　 3、YB-L1EPO对多药耐药肿瘤细胞周期的影响　　 本实验采用流式细胞仪分析了YB-L1EPO对K562/A02细胞周期移行的影响。经不同浓度的YB-L1EPO（0.05μmol/L、0.2μmol/L）作用于K562/A02细胞24h、36h、48h后，发现细胞各时相都有所抑制的同时，24h、36h时间点的细胞周期被阻断在S期，而48h时间点的细胞周期被阻断在G1期。这说明YB-L1EPO作用24h、36h后，药物进入细胞核内，细胞被阻滞在DNA合成期；而作用48h后，细胞在DNA合成前就被阻滞。　　 4、YB-L1EPO诱导多药耐药肿瘤细胞凋亡　　 YB-L1EPO能够诱导K562/A02细胞凋亡。不同浓度的YB-L1EPO（0.05μmol/L、0.1μmol/L）.作用于K562/A02细胞24小时后，用荧光染料Hoechst33342对细胞进行染色，在紫外光（340nm）激发下发出蓝色荧光。荧光显微镜下观察发现YB-L1EPO可使细胞核染色质发生聚集、碎裂，细胞核固缩呈均一的致密物，进而断裂，细胞膜不断出芽、脱落，细胞变成数个大小不等的凋亡小体，并且随着给药浓度的加大，镜下这种细胞形态的变化愈来愈明显，表明凋亡细胞的比例逐渐增加。在DNA凝胶电泳实验中，用不同浓度的YB-L1EPO（0.05、0.1、0.2μmol/L）作用于K562/A02细胞24小时，提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳，呈现“DNA梯子”（DNA ladder）。流式细胞仪进行细胞的DNA含量测定，可见不同浓度的YB-L1EPO（0.05μmol/L和0.2μmol/L）作用于K562/A02细胞24小时后，即开始出现细胞凋亡，且凋亡细胞的比例随着YB-L1EPO浓度的升高和作用时间韵延长而增加，呈一定的剂量与时间依赖性。从以上三方面的结果可以认为YB-L1EPO能够诱导多药耐药肿瘤细胞凋亡。　　 5、YB-L1EPO对多药耐药性基因mdr-1、凋亡相关基因p53、bcl-2、bax、p21、caspase3表达及mdr-1编码的蛋白P-gp表达的影响　　 本实验观察了YB-L1EPO对mdr-1基因及凋亡相关基因p53、bcl-2、bax、p21和caspase3的mRNA表达的影响。经不同浓度的YB-L1EPO（0.05、0.1、0.2μmol/L）作用于K562/A02细胞24dx时，RT-PCR结果显示YB-L1EPO可增加p53、p21、caspase3及bax的mRNA表达，同时降低了bcl-2和mdr-1mRNA的表达，结果同对照组相比均有显著性差异（P），且呈一定的剂量依赖性。提示YB-L1EPO诱导细胞凋亡的作用极可能依靠上调了p53、p21、caspase3以及Bax的mRNA表达，同时协同下调抑制凋亡基因Bcl-2和多药耐药性基因mdr-1 mRNA的表达，从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。本实验观察了YB-L1EPO对多药耐药相关蛋白P-gp表达的影响。经不同浓度的MS-275-6（0.05、0.1、0.2μmol/L）作用于K562/A02细胞24小时，免疫组化及western blot结果显示YB-L1EPO可使P-gp蛋白的表达量降低，且呈一定的剂量依赖性。　　 结论:YB-L1EPO在体外能够抑制多种人源性肿瘤细胞及多药耐药肿瘤细胞的生长，其抗肿瘤活性与鬼臼毒素相当。对于小鼠移植性肿瘤有较好的抑制作用。通过依赖p53途径，上调p21、caspase3及bax基因表达，同时协同下调mdr-1基因及Bcl-2基因的表达；下调mdr-1的表达产物——P-gp蛋白的表达；阻滞多药耐药肿瘤细胞在S期和G1期，从而诱导其凋亡，有望成为一个新型的抗多药耐药肿瘤化合物。