研究背景:恶性肿瘤是导致人类死亡的重大原因之一。2015年中国癌症统计结果显示,中国约有429万癌症新发病例。另有280万人因癌症去世。在肿瘤发生发展进程中,肿瘤细胞有效逃逸免疫系统攻击可能是造成疾病进展的关键原因,因此提高抗肿瘤的免疫治疗可能是彻底清除肿瘤细胞的方法之一。以往的细胞治疗方法大多是基于T细胞的研究和临床试验,包括LAK细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞、γδT细胞、TIL细胞、TCR细胞等。基础研究表明,大部分的肿瘤细胞通过低表达MHC-I类分子,从而逃逸T淋巴细胞的杀伤。而NK(Natural Killer,NK)细胞由于其非MHC限制性,可以识别并杀伤MHC-I缺失的细胞,具备很好的免疫细胞治疗的潜能。NK是天然免疫系统重要的组成部分,是机体对抗病原体和肿瘤的第一道防线,不仅在免疫监视过程中发挥着重要作用,而且具有很好的抗病毒、抗感染和杀伤肿瘤细胞的功能。NK细胞的活化取决于细胞表面抑制性受体信号和激活受体信号的协同调节。在正常的生理条件下,激活受体和抑制性受体表达处于平衡状态,当机体有肿瘤发生或遭受病原体攻击致使体细胞MHC I类分子表达异常,NK细胞杀伤功能被激活。NK细胞能够在没有被预先致敏的情况下杀伤肿瘤细胞;NK细胞也可以通过ADCC效应,使细胞表面CD16分子与肿瘤细胞IgG抗体复合物结合后,活化蛋白酪氨酸激酶,进而释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒性物质,最终导致肿瘤细胞凋亡;此外,NK细胞还可以通过产生多种细胞因子调节免疫系统应答达到杀伤肿瘤的作用。因此,NK细胞被认为是理想的过继免疫细胞。由于NK扩增技术的发展和成熟,国际上应用NK细胞治疗肿瘤的研究日益增多,且显示出良好的安全性。用于体外扩增的NK细胞的来源包括脐带血、自体或异体外周血等,扩增的方法包括抗体刺激法、可溶性细胞因子鸡尾酒法以及滋养细胞扩增法等。目前研究结果表明,自体NK细胞过继免疫治疗能够提高机体NK细胞数量和活性,但在清除肿瘤方面未发现明显效果,异体NK细胞过继免疫治疗在清除肿瘤方面显示出良好的安全性和很好的治疗效果,但临床资料较少,相关作用机制仍不明确。研究目的:建立完善的异体NK细胞扩增、质量控制及临床治疗方案;通过随访研究确定HLA半相合NK细胞治疗实体肿瘤的安全性和疗效性;探索异体NK细胞体外及体内抗肿瘤机制。实验方法用抗体包被与多种细胞因子共刺激的方法对我院14例实体瘤患者直系血亲外周血单个核细胞进行培养,分别于14、15天连续两次将体外培养的NK细胞回输给患者,观察并记录异体NK细胞过继回输反应。通过临床随访观察患者NK细胞过继回输治疗前基线水平及治疗后4、12、24、36、48周后血常规、肝肾功能、凝血、肿瘤标志物及影像学等临床资料并获取血液样本。对于血液样本,用流式细胞检测方法及免疫学手段检测患者免疫指标及NK细胞功能相关受体表达。对于体外培养的NK细胞,观察并记录培养过程中NK细胞数量、状态、活细胞率,同时应用流式细胞检测法检测不同培养时间点NK细胞频率及淋巴细胞亚群变化;分别用PMA+离子酶素、K562细胞、HepG2细胞对所培养NK细胞进行刺激,检测其CD107a、IFN-γ、TNF-α的表达情况;应用所培养NK细胞和CFSE标记的K562细胞、HepG2细胞共培养4-8小时,分别以0:1、3:1、10:1、30:1的效靶比检测NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力。实验结果1、通过优化培养方法和流程,我们制定了NK细胞体外扩增的标准操作流程。采集供者50-80ml外周血,分离外周血单个核细胞,扩增培养可得到2-8×10~9个细胞,其中NK细胞占总细胞数的49%-88%。2、体外杀伤实验表明,培养的NK细胞对HepG2肝癌细胞系具有显著的杀伤能力,并与效靶比成正相关,而且添加IL-2可以进一步提高NK细胞对HepG2细胞的杀伤能力。3、回输后,14例实体瘤患者34例次NK细胞回输过程中,所有患者均无肝脏功能、肾脏功能、心血管功能及其他机体组织功能损伤,无急性或慢性GVHD反应。其中12例次NK细胞过继回输后患者在24小时内有不同程度的一过性发热,其中体温达到37.3℃-38.5℃11例次,38.5℃-39.5℃1例次,最长持续12小时,所有患者未经任何治疗均自行缓解。4、8例肝癌患者中,1例完全应答,4例部分应答;4例肺癌患者中2例部分缓解,其中一例肿瘤病灶缩小超过80%;2例卵巢癌均为疾病稳定状态,病灶未见明显变化。5、所培养的NK细胞在PMA联合离子酶素刺激下均能高表达CD107a、IFN-γ、TNF-α,K562细胞系和HepG2细胞系刺激均能显著提高NK细胞分泌CD107a、IFN-γ和TNF-α的水平,且K562细胞系较HepG2细胞系表现出更强的刺激功能。加入IL-2能够显著增强NK细胞分泌CD107a、TNF-α的水平,表明在NK细胞活化及发挥功能过程中,IL-2起重要作用。6、异体NK细胞过继回输24小时,患者体内CD4+T细胞频率显著升高,且CD4+/CD8+显著升高。NK细胞频率在过继回输大量外源性NK细胞的同时仍显著下降。用培养的NK细胞和患者PBMC共培养在加IL-2组合对照组均为检测到外源性的NK细胞对患者PBMC均无杀伤现象。7、异体NK细胞过继回输后,在所有淋巴细胞中,B细胞和CD4+T细胞频率较原水平升高,但从绝对计数来看,患者体内NK细胞、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞均较治疗前下降。B细胞在回输后48小时降低至最低点,NK细胞及T细胞在回输后24小时降低至最低点,之后逐渐回升,第5天左右恢复至正常水平。8、治疗后患者NKG2A、NKG2D和NK p46表达水平较治疗前显著升高,表明异体NK细胞过继回输后,提高了患者机体内NK细胞抗肿瘤水平。结论1、可以实现NK细胞在体外的大量培养,并且培养的NK细胞具有良好的抗肿瘤功能。2、直系亲属来源的HLA半相合NK细胞过继治疗实体肿瘤具有良好的安全性。3、HLA半相合NK细胞对肝癌、肺癌等实体肿瘤的治疗中具有很好的抗肿瘤疗效。