原发性脑干损伤(primary brain stem injury,PBSI)是一类特殊的脑损伤，包括原发性脑干轴索损伤、挫裂伤和出血等，是颅脑损伤致死的重要原因之一，也是法医学尸检中常见的损伤。由于脑干损伤后死亡率较高、死亡者伤后存活时间短，伤后症状和其它类型颅脑损伤存在交叉，一般影像学检查及死后常规病理检查常难以确定脑干是否存在损伤，给PBSI的临床医学诊断以及法医病理学诊断带来困难，特别是脑干局部的微小损伤灶是否导致死亡的法医学认定。因此，寻找稳定、可靠的免疫组织化学指标及检测方法对PBSI的诊断以明确死亡原因成为法医病理学一个亟需解决的现实问题。近来动物实验研究表明，颅脑损伤后神经元中热休克蛋白70(heat shock protein 70，Hsp70)的表达参与了神经元损伤的应激反应，表达增加的Hsp70在维持神经元蛋白质自稳方面发挥作用，是细胞自我保护的一种重要机制；此外，也有研究表明，颅脑损伤后神经元内Ced-3基因家族的半胱天冬酶(cystein-dependent aspartate-specific protease,Caspase)家族成员中的Caspase-3表达增加，促进细胞凋亡，是凋亡的执行因子，在神经元凋亡过程中发挥重要的作用。但是脑干损伤后神经元内Hsp70、Caspase-3表达变化，特别是在人体脑干内作为生命中枢的神经核团，如迷走神经核、网状结构中的变化及其与神经元凋亡的关系，目前未见有相关报道。目的观察原发性脑干损伤死亡者脑干内与生命活动密切相关的神经核团(迷走神经背侧核、网状结构外侧核群)神经元中Hsp70、Caspase-3的表达、神经元凋亡情况，及其随伤后存活时间变化的规律，探讨Hsp70、Caspase-3与神经元凋亡的关系，为原发性脑干损伤致死的病理学诊断、法医学死因推断提供稳定、简便、可行的检测指标及方法。 材料与方法 1.研究对象 人体脑干检材为广州市刑事科学技术研究所2005年-2007年收集的尸体解剖检案中符合实验要求的脑干标本30例，男27例，女3例，年龄3～75岁。伤后存活时间：5分钟～24小时，解剖时间于死后48小时以内。阴性对照组5例(排除颅脑损伤)，死因为冠心病致心性猝死。按伤后存活时间长短，将脑干损伤组分为以下四个组：Ⅰ组：伤后存活时间≤5分钟；Ⅱ组：5分钟<存活时间≤15钟组；Ⅲ组：15分钟<存活时间≤1小时；Ⅳ组：1小时<存活时间≤24小时。对照组在数据统计、分析中以Ⅴ组表示。 2.实验方法 人体脑干标本经10％福尔马林固定24h后，按文献规范的取材方法，分别于动眼神经根平面；三叉神经根部至脑桥第四脑室壁平面；延脑迷走神经(上部)、舌下神经根(上部)至延脑第四脑室壁平面水平切取2mm厚组织块，石蜡包埋、连续切片10张，片厚4-5μm，分别进行HE染色、Hsp70、Caspase-3免疫组织化学染色和TUNEL染色。记录Hsp70、Caspase-3在目标核团神经细胞中阳性表达的情况。 3.统计学分析 在选定视野下对阳性细胞计数，所得数据输入Microsoft Excel数据库，应用SPSS 13.0 for windows对数据进行统计处理。计量资料以均数±标准差(-χ±s)表示，多组均数比较采用方差分析，P<0.05为有统计学意义；组间变量采用相关分析，P<0.05为有统计学意义。 结果 1.原发性脑干损伤后神经核团内神经元Hsp70阳性细胞数显著高于正常对照组(p<0.05)；伤后存活超过15分钟各组中Caspase-3阳性细胞数及凋亡细胞比率显著高于正常对照组(p<0.05)； 2.本研究所观察的损伤后存活时间段内，原发性脑干损伤各组所选取神经核团内神经元Hsp70、Caspase-3阳性细胞数及凋亡细胞比率有随伤后存活时间延长而增加的趋势。 3.原发性脑干损伤后存活时间大于15分钟各组延脑，经TUNEL染色迷走神经背侧核团及网状结构中部分神经细胞核染成棕黄色，表明神经细胞出现凋亡。损伤组神经元内Caspase-3的表达与神经元凋亡之间存在正相关关系(r为0.645，p<0.05)。 结论 1.原发性脑干损伤后HSP70在神经细胞中表达增加，参与神经细胞对损伤的应激反应。免疫组化方法检测脑干重要神经核团神经元中HSP70的表达，可以应用于原发性脑干损伤早期的法医病理学辅助诊断； 2.原发性脑干损伤15分钟后Caspase-3在神经细胞中开始出现表达，引起神经细胞凋亡。应用免疫组化方法检测脑干重要神经核团神经元中Caspase-3的表达，可以为原发性脑干损伤后存活时间超过15分钟死亡者的法医病理学诊断提供参考； 3.原发性脑干损伤后15分钟～1小时，神经细胞出现凋亡，应用TUNEL染色可以辅助原发性脑干损伤的法医病理学诊断。