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脂肪酶是一类可催化甘油三酯水解生成甘油及长链脂肪酸的水解酶。来源于耶氏解酯酵母的胞外脂肪酶LipY2,由于其在较低pH下仍具有较高的稳定性且活性不受胆盐的抑制,因此可作为口服类替代药物治疗胰腺炎引起的胰酶分泌不足等疾病。然而该酶在口服过程中,常因其易被胰蛋白酶降解而降低疗效。故本研究拟通过蛋白质工程手段对LipY2进行分子改造,以提高其对胰蛋白酶的抗性。本研究将肪酶基因lipY2克隆至分泌型质粒pPIC9K上,并在毕赤酵母GS115中实现了异源表达。摇瓶发酵条件下,甲醇诱导培养60 h后重组脂肪酶LipY2的表达量最高达到1033 U/mL。同时根据脂肪酶LipY2的胰蛋白酶酶解质谱分析以及脂肪酶的三维结构分析,利用序列比对及同源建模相结合的手段,确定了 LiPY2中易被胰蛋白酶降解的位点。并针对这些位点,对lipY2基因进行了定点改造,构建了 7个突变体,分别为M36、M63、M215以及组合突变体M36-63、M36-215、M63-215和M36-63-215。分别研究了不同位点的改变,对LiPY2的酶活、抗胰蛋白酶水解稳定性及酸稳定性等酶学性质的影响,结果如下:与LipY2相比,M36(突变位点为K36、K39)的最适pH下降了一个单位,在相同浓度胰蛋白酶处理下的半衰期提高了 8.1%;M63(突变位点为R63)的最适pH也下降了一个单位,在相同浓度胰蛋白酶处理下的半衰期提高了 16.6%;M36-63(突变位点为K36、K39、R63)最适pH同样下降了一个单位,在相同浓度胰蛋白酶处理下的半衰期提高了 22.3%。突变体M36、M63和M36-63的酶活力与LipY2基本相同,但在较低pH 1～3范围内的稳定性以及对胰蛋白酶的抗性都有所提高,尤其以M36-63的效果最为显著。而M215(突变位点为K215、K218、R220)及 M36-215(突变位点为 K36、K39、K215、K218、R220)、M63-215 突变位点为(R63、K215、K218、R220)和 M36-63-215(突变位点为 K36、K39、R63、K215、K218、R220)的酶活力却非常低。